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Apr 19, 2024

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 474 (2023) Citar este artículo

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Se ha desarrollado la tecnología de molienda con haz de iones crioenfocado (crio-FIB) para la fabricación de crio-lamelas de especímenes nativos congelados para su estudio mediante tomografía crioelectrónica in situ (crio-ET). Sin embargo, la precisión del objetivo de interés sigue siendo uno de los principales obstáculos que limitan la aplicación. Aquí, hemos desarrollado un sistema de microscopía criocorrelativa de luz y electrónica (crio-CLEM) llamado HOPE-SIM mediante la incorporación de un sistema de microscopía de fluorescencia de iluminación estructurada (SIM) 3D y una etapa de alto vacío mejorada para lograr crio-FIB dirigido de manera eficiente. Con la súper resolución 3D de crio-SIM, así como nuestro software crio-CLEM, 3D-View, la precisión de correlación de la región de interés objetivo puede alcanzar 110 nm, suficiente para la posterior fabricación de crio-lamelas. Hemos utilizado con éxito el sistema HOPE-SIM para preparar crio-lamelas dirigidas a mitocondrias, centrosomas de células HeLa y compartimiento de ensamblaje de herpesvirus de células BHK-21 infectadas, lo que sugiere la alta potencia del sistema HOPE-SIM para futuras crio-ET in situ. flujos de trabajo.

Revelar ultraestructuras celulares tridimensionales (3D) es un paso importante para comprender la vida. En los últimos años, la microscopía crioelectrónica (crio-EM) ha mejorado cada vez más y se está convirtiendo en una de las principales técnicas biofísicas utilizadas para estudiar estructuras 3D de alta resolución de complejos macromoleculares1. Además, la tomografía crioelectrónica (crio-ET) ha surgido como otra herramienta poderosa para visualizar la organización macromolecular de paisajes celulares imperturbados con el potencial de alcanzar una resolución casi atómica2,3,4. Para visualizar la ultraestructura subcelular en células vitrificadas mediante crio-ET, se ha utilizado molienda con haz de iones enfocado en condiciones criogénicas (crio-FIB) para preparar crio-lamelas delgadas a partir de células vitrificadas, lo que permite muchas observaciones biológicas interesantes dentro de las células. La organización tridimensional de los orgánulos celulares, como el citoesqueleto5,6,7,8,9, el retículo endoplásmico (RE)10 y el proteasoma 26S11, se ha analizado con éxito mediante crio-ET.

Existen varias limitaciones que impiden una aplicación más amplia de la crio-ET, incluidas las dificultades para localizar e identificar características de interés12. Se ha demostrado que la microscopía criocorrelativa de luz y electrónica (crio-CLEM)13,14,15,16,17,18 es un enfoque eficaz para superar este problema mediante el uso de etiquetado fluorescente para navegar hacia el objetivo para la crio-FIB posterior. molienda de células vitrificadas14,15,16,17 o imágenes crio-ET de secciones hidratadas congeladas12,18. Teniendo en cuenta que el grosor normal de las células está mucho más allá del camino libre medio de los electrones de 300 keV, es necesaria la fabricación de células vitrificadas hasta un grosor de ~ 200 nm antes de la recopilación de datos crio-ET. Por lo tanto, el procedimiento experimental secuencial de vitrificación, microscopía de criofluorescencia (crio-FM), crio-FIB y crio-ET se ha convertido en un flujo de trabajo de rutina para muchos estudios estructurales in situ específicos del sitio12,19,20,21,22. 23. Este flujo de trabajo normalmente requiere un microscopio de fluorescencia independiente con una etapa criogénica para obtener imágenes de criofluorescencia15,16,17,24,25, seguido de microscopía electrónica de barrido criogénico (crio-SEM). Se genera una alineación de correlación entre las imágenes crio-FM y crio-SEM y se utiliza para guiar el fresado crio-FIB12,18,21,26. Además, se requieren marcadores fiduciales específicos obtenidos mediante crio-FM y crio-FIB, como perlas fluorescentes, para el alineamiento de la correlación utilizando un software correlativo 3D específico21,27. Se han informado muchas implementaciones de hardware para realizar este flujo de trabajo mediante el desarrollo de microscopía de fluorescencia criogénica de campo amplio13,21,22 o microscopía confocal crio-Airyscan (CACM) de alta resolución12.

La precisión de la correlación y la tasa de éxito entre crio-FM y crio-FIB están limitadas por la resolución de crio-FM y atenuadas aún más por los factores de deformación de la muestra, desvitrificación y contaminación por hielo7,21. Anteriormente desarrollamos una plataforma óptica de alto vacío única para crio-CLEM (HOPE)25, que utilizaba un soporte criogénico integrado y una cámara de vacío específica para minimizar la contaminación por hielo y reducir el riesgo de deformación y desvitrificación de la muestra durante la obtención de imágenes crio-FM y transferencia de muestras. Sin embargo, el uso de un microscopio de fluorescencia de campo amplio con una lente objetivo de baja apertura numérica (NA) y sin la información de la posición z de los objetivos fluorescentes en nuestro sistema HOPE ha limitado la precisión de la correlación por encima de una micra, lo que debe mejorarse. para aumentar la tasa de éxito de la molienda crio-FIB específica del sitio.

La microscopía de iluminación estructurada (SIM) introduce una luz de iluminación modelada en el objetivo de la imagen, lo que da como resultado franjas de interferencia de baja frecuencia que transportan información estructural más allá del límite de difracción del sistema, lo que duplica la resolución de la microscopía de fluorescencia de campo amplio convencional y permite la visualización de Procesos moleculares detallados en toda la célula5,28,29. En comparación con otras técnicas de FM de superresolución, como la microscopía de localización fotoactivada (PALM)30, la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM)31, la nanoscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED)32 y la microscopía 4Pi33, SIM utiliza una potencia de iluminación relativamente baja (10–100 mW cm- 2) y no requiere fluoróforos especiales ni lentes objetivos para duplicar la resolución limitada por difracción en tres dimensiones28,34,35,36,37,38. La baja potencia de iluminación minimiza el efecto de calentamiento sobre la muestra, lo cual es importante para evitar el riesgo de desvitrificación39,40 para muestras hidratadas congeladas. Por lo tanto, SIM se ha empleado recientemente en microscopía correlativa con microscopía de rayos X suaves para visualizar células en hielo vítreo35.

En este trabajo, a partir de nuestro sistema HOPE desarrollado previamente25, desarrollamos un sistema de microscopía criocorrelativa de luz y electrónica (crio-CLEM) con el nombre HOPE-SIM para lograr crio-FIB dirigido de manera eficiente. Actualizamos el microscopio de fluorescencia de campo amplio a un sistema 3D-SIM para aumentar la resolución de imágenes de FM en las dimensiones x e y y obtener información adicional en la dimensión z, lo que mejora en gran medida la precisión de la correlación para guiar la fabricación de crio-FIB específica del sitio. . También actualizamos el sistema de alto vacío para mejorar el vacío de la cámara y reducir aún más la tasa de crecimiento del hielo, lo que permite un tiempo más largo de obtención de imágenes crio-FM antes de que la muestra se congele. También desarrollamos un software correlativo 3D específico, 3D-View, para realizar la correlación basada en marcadores fiduciales entre imágenes crio-SIM y crio-FIB, que se utiliza para navegar con precisión el fresado crio-FIB.

Medimos la precisión de apuntar a la región de interés, que puede alcanzar hasta 110 nm. Y aplicamos con éxito el flujo de trabajo crio-CLEM basado en HOPE-SIM para atacar las mitocondrias, el compartimento de ensamblaje del virus del herpes de las células BHK-21 infectadas y los centrosomas de las células HeLa.

Nuestro sistema HOPE-SIM (Figs. 1 y 2a, Fig. 1 complementaria y Película complementaria 1) se actualizó desde nuestro sistema HOPE desarrollado anteriormente25. En primer lugar, se diseñó y montó una cámara de alto vacío más grande en un microscopio de epifluorescencia comercial (p. ej., modelo IX73, Olympus Corporation, Japón) con una lente objetivo seca de larga distancia de trabajo de alta apertura numérica (NA) (p. ej., Nikon CFI TU Plan Apo EPI ×100, NA/WD: 0,9/2 mm) montado en la cámara. Colocar la lente objetivo dentro de la cámara de vacío permite la utilización de una lente de alta NA para aumentar la resolución de FM. Al igual que nuestro diseño anterior, un sistema de transferencia de vacío con un dispositivo de prebombeo está conectado a la cámara de vacío a través de un fuelle y una válvula de compuerta manual, lo que permite transferir un soporte criogénico comercial a la cámara de vacío y la muestra criogénica. para colocarse encima de la lente del objetivo en el camino de la luz. El movimiento del crio-soporte es impulsado por una etapa de motor eléctrico de tres ejes que está fijada a la cámara de vacío. A diferencia de nuestro sistema HOPE, se diseñó un sistema anticontaminación (ACS) insertado, que fija un recipiente de nitrógeno líquido dentro de la cámara de vacío para enfriar una caja criogénica (Fig. 2a y Fig. 1b complementaria). Esta caja criogénica con una temperatura de trabajo inferior a -175 ° C se utiliza para enjaular la punta del soporte criogénico (Figuras complementarias 1c-e) y proteger la muestra criogénica de la deposición/contaminación de hielo. Además, hay dos puertos diseñados a la izquierda de la cámara de vacío, con un puerto conectado a un sistema de bomba turbo (TPS) y otro conectado a un vacuómetro (Figuras complementarias 1a, b). Se utiliza un TPS de alta potencia para lograr un vacío mejorado superior a 5 × 10-5 Pa en condiciones criogénicas. Diseñamos un dispositivo de pantalla táctil para monitorear los niveles de vacío tanto de la cámara como de la válvula de compuerta, el estado de bombeo y la temperatura de la caja criogénica (Figura complementaria 1a). Para monitorear el sistema alrededor de la lente objetivo dentro de la cámara, diseñamos una ventana de vidrio de observación frente a la cámara (Figuras complementarias 1a, b, e). Para permitir que la luz pase a través de la cámara de vacío, hay dos ventanas ópticas de vidrio diseñadas en la parte superior e inferior de la lente del objetivo (Figura complementaria 1f, g).

Las células vitrificadas en rejillas EM son demasiado gruesas para poder obtener imágenes directamente mediante crio-EM. El fresado ciego mediante crio-FIB carece de precisión para apuntar a la región de interés (ROI), que debe resolverse mediante crio-CLEM. Primero se tomaron imágenes de las células vitrificadas mediante crio-FM y se examinaron con buenas señales fluorescentes. Se capturaron las imágenes fluorescentes de ambas microesferas (azules) y ROI. Luego, las imágenes fluorescentes se correlacionan con imágenes crio-FIB alineando las posiciones de las microesferas (registro de marcador fiduciario). Luego, la correlación precisa se utiliza para guiar el fresado crio-FIB preciso para preparar las crio-lamelas objetivo del ROI para el posterior estudio crio-ET in situ. En los paneles de la derecha se muestra un ejemplo que utiliza crio-SIM del sistema HOPE-SIM para demostrar todo el flujo de trabajo de crio-CLEM. Para esta demostración se utilizaron células HeLa teñidas con MitoTracker Red CMXRos (canal rojo). Se tomaron imágenes de las microesferas fluorescentes en el canal verde y se correlacionaron con la imagen crio-FIB, donde las microesferas están marcadas con cruces. Se realizó un fresado crio-FIB preciso con la guía de la correlación 3D, y la posterior reconstrucción crio-ET mostró la ubicación de las mitocondrias objetivo in situ.

a Descripción esquemática del diseño del sistema HOPE-SIM en su modo operativo. Cada parte del sistema está etiquetada y descrita en el texto. A través de la entrada de retroiluminación se induce un haz de iluminación estructurado en el microscopio. Sistema turbobomba TPS, sistema anticontaminación ACS, espejo dicroico DM, microscopía de iluminación estructurada SIM, modulador de luz espacial SLM, placa de media onda HWP, divisor de haz polarizador PBS. b Subimágenes correspondientes esquemáticas (arriba) y reales (abajo) de los patrones de iluminación crio-SIM (blanco y negro) en las microesferas de fluorescencia (azul). c Comparaciones de imágenes fluorescentes de microesferas de 1 μm entre diferentes modos de imagen: campo amplio (WF), deconvolución y crio-SIM. Está claro que crio-SIM produce la imagen con la mejor resolución tanto en el plano XY como en el YZ.

Para evitar tocar la rejilla directamente en el crio-FIB y crio-ET posteriores, seleccionamos FEI AutoGrid para la transferencia de muestras criogénicas durante todo el flujo de trabajo de crio-CLEM. Se utilizó un soporte criogénico de inclinación única para múltiples muestras (Modelo 910.6, Gatan, EE. UU.) para transferir la muestra criogénica a la cámara de vacío y mantener la condición criogénica durante la obtención de imágenes crio-FM. Para colocar AutoGrid con este soporte criogénico comercial, utilizamos nuestra punta de soporte41 informada anteriormente (Fig. 1c, d complementaria) para sostener AutoGrid montado con nuestras rejillas de buscador en forma de D42 (Fig. 1c complementaria). Esta punta de soporte especial es importante para proteger las muestras criogénicas de daños y proporcionar suficiente estabilidad mecánica para la obtención de imágenes crio-FM posteriores.

Además de actualizar el sistema de vacío y la mecánica, también actualizamos el microscopio de fluorescencia de campo amplio de nuestro sistema HOPE a SIM (Fig. 2 y Fig. 2 complementaria), que utiliza una fuente láser con tres canales (561 nm/488 nm). /405 nm) y un modulador de luz espacial (SLM, QXGA-3DM, Forth Dimension Displays) para generar un patrón de iluminación estructurado. El objetivo recoge las señales de fluorescencia resultantes y las registra en una cámara sCMOS de alta sensibilidad (Prime 95B, Photometrics). Se pueden obtener datos sin procesar de 3D-SIM para reconstruir una pila de series de imágenes de fluorescencia que se utilizarán para la correlación posterior y la navegación crio-FIB.

Para controlar todo el sistema (láser, SLM, escenario y cámara) de HOPE-SIM y ser compatible con la correlación posterior, diseñamos un software basado en LabVIEW (National Instrument, EE. UU.), HOPE-SIM View (Figura complementaria 3). ). HOPE-SIM View se puede utilizar para configurar parámetros de imágenes crio-FM (p. ej., el tiempo de exposición y la zona de enfoque), mapear el área de toda la cuadrícula, registrar la lista de objetivos de interés (Figura complementaria 3a), configurar la exposición tiempo (Figura complementaria 3b), cambie el canal del láser y la intensidad de potencia (Figura complementaria 3c), controle el movimiento del escenario (Figura complementaria 3d) y recopile datos sin procesar 3D-SIM multicanal.

Usando nuestro sistema HOPE-SIM, podemos incorporar imágenes crio-SIM en el protocolo estándar actual de crio-CLEM (Fig. 1). En detalle, la rejilla del buscador en forma de D se utiliza para hacer crecer las células hasta una densidad adecuada, y luego las células se transfectan para expresar moléculas marcadas fluorescentemente objetivo o se tiñen con tintes fluorescentes. Antes de la congelación por inmersión, se añade al cultivo de la rejilla una cantidad adecuada de microesferas fluorescentes diluidas con un tamaño recomendado de 1 micrón de diámetro. Luego, la rejilla vitrificada se ensambla en AutoGrid y se monta en nuestra punta especialmente diseñada que se coloca en el crio-multi-soporte para la posterior obtención de imágenes crio-SIM. En particular, el lado de la rejilla con las células en crecimiento debe mirar hacia la lente del objetivo.

Antes de obtener imágenes crio-SIM, la cámara de vacío del sistema HOPE-SIM debe bombearse a un alto vacío de ~5 × 10-5 Pa, y el ACS debe enfriarse a menos de -170 °C con nitrógeno líquido, que Es importante reducir la tasa de crecimiento del hielo durante las imágenes crio-SIM (Figura complementaria 4 y Datos complementarios 1 y 8). Luego, el dispositivo de transferencia de vacío inserta el crio-multisoporte en el sistema HOPE-SIM. Después de ~5 minutos de tiempo de espera para recuperar el vacío de la cámara y otros ~5 minutos para que se estabilice la temperatura de la punta del soporte, el obturador del crio-multi-soporte está abierto y listo para la selección de muestras y la obtención de imágenes crio-SIM. . Primero se examina la rejilla congelada en modo de transmisión de imágenes de campo amplio y se verifican la concentración de células, las posiciones de las células en el cuadrado, la integridad de la película de soporte, la contaminación por hielo y el espesor de la muestra. Las regiones con células que muestran una buena señal fluorescente en la posición correcta del cuadrado, una película de soporte continua, un espesor de hielo apropiado y perlas fluorescentes bien dispersas se seleccionan y registran como ROI (regiones de interés) en HOPE-SIM View para la posterior recopilación de datos crio-SIM en 3D. El campo de visión del sistema HOPE-SIM, de aproximadamente 140 micrones, cubre exactamente un cuadrado completo de una cuadrícula de 200 mallas. Y las imágenes 3D multicanal pueden capturar tanto marcadores fiduciales como moléculas fluorescentes objetivo.

Después de obtener imágenes crio-SIM, la rejilla congelada ensamblada con AutoGrid se transfiere a un crio-SEM de doble haz (por ejemplo, FEI Helios NanoLab 600i) a través de nuestro protocolo desarrollado previamente y crio-obturador42. Desarrollamos el software basado en LabVIEW (National Instrument, EE. UU.), 3D-View (Figura complementaria 5), ​​para la correlación de imágenes entre diferentes microscopios (Película complementaria 2). En primer lugar, toda la cuadrícula se examina mediante imágenes crio-FIB con bajo aumento, y las posiciones de las regiones de interés se pueden encontrar a través del índice del Finder. Las regiones de interés con células que tienen buena forma y densidad adecuada se seleccionan para obtener imágenes crio-FIB posteriores con un aumento adecuado de × 2500 (Figuras complementarias 5a, b). En segundo lugar, las posiciones de las perlas fluorescentes de las imágenes crio-SIM y crio-FIB correspondientes se seleccionan para una correlación precisa utilizando 3D-View (Figura complementaria 5b) (el algoritmo detallado se describe en Métodos). Después de la correlación de la imagen, se pueden obtener y mostrar el ángulo de Euler optimizado y la desviación estándar (SD) minimizada (Figuras complementarias 5c-e). Finalmente, la imagen crio-SIM se puede fusionar con la imagen crio-FIB (Figura complementaria 5f) para resaltar el objetivo para la posterior fabricación crio-FIB.

Usando AutoGrid, la crio-lamela preparada está lista para el experimento crio-ET usando un microscopio crioelectrónico de 300 kV (por ejemplo, FEI Titan Krios). La imagen crio-SIM también es útil para ayudar a localizar el ROI para la recopilación de datos crio-ET.

Utilizando el protocolo del software de código abierto SIM-Check43, medimos la resolución y verificamos la estabilidad/calidad de nuestro sistema crio-SIM (Figuras complementarias 2d-i). Como resultado, se logró una resolución lateral de ~ 200 nm y una resolución en la dirección z de ~ 500 nm (Figura complementaria 2e, f), que son mejores que la imagen de campo amplio y la imagen de deconvolución (Figura 2c). . La resolución mejorada y la relación señal-ruido mejoraron la precisión de las coordenadas z determinadas de las microesferas fluorescentes, lo cual es importante para la precisión de correlación posterior entre las imágenes crio-SIM 3D y crio-FIB 2D.

Luego medimos la precisión de orientación del crio-FIB guiado por la información de correlación 3D en 3D-View. En nuestra primera medición (Fig. 3a-e), distribuimos dos microesferas fluorescentes de diferentes tamaños y colores (verde/0,5 μm, 505/515 nm, F8813, Thermo Fisher Scientific Corp., OR., rojo/0,2 μm, 580/ 605 nm, F8810, Thermo Fisher Scientific Corp., OR.) en una rejilla TEM GraFuture RGO (GraFutureTM-RGO001A, Shuimu BioSciences Ltd., CN) y lo dejó seco. Esta cuadrícula se utilizó para medir la precisión de la correlación entre las imágenes crio-SIM y crio-FIB. Registramos los canales verde y rojo de imágenes crio-SIM (Fig. 3a), seleccionamos el canal de microesferas fluorescentes verdes para correlacionar las imágenes crio-SIM 3D y crio-FIB 2D (Fig. 3b-d), y luego calculamos el desviación estándar de las microesferas fluorescentes rojas (consulte la ecuación (8) en "Métodos"), lo que da como resultado una precisión de correlación de 110 nm (Fig. 3e y Datos complementarios 2).

Imágenes HOPE-SIM de microesferas fluorescentes secas verdes de 0,5 μm y rojas de 0,2 μm distribuidas en una rejilla GraFuture RGO. Las microesferas verdes marcadas con círculos y cruces blancos se utilizan como marcadores de registro fiduciario. Las microesferas rojas etiquetadas del 1 al 9 se utilizan para medir la precisión de la correlación con la imagen FIB. b La proyección de la imagen HOPE-SIM después de la correlación 3D con la imagen FIB. Las microesferas correspondientes a las microesferas verdes en (a) están marcadas con círculos y cruces blancos. cImagen FIB. Las microesferas correspondientes a las microesferas en (a) y (b) están etiquetadas con círculos blancos y cruces en consecuencia. d Correlación 3D entre imágenes HOPE-SIM y FIB. Las microesferas etiquetadas con círculos rojos y etiquetadas del 1 al 9 corresponden a las microesferas rojas en (a), respectivamente. e Desviaciones de posición correspondientes de las nueve microesferas rojas entre (a) y (d), respectivamente. f Imagen HOPE-SIM de una solución vitrificada de microesferas azules fluorescentes (canal verde) mezcladas con perlas de polimetacrilato de metilo que se dejaron caer directamente sobre la rejilla EM. La imagen de fluorescencia (color verde) se fusiona con la imagen de campo brillante. Se seleccionan como objetivos cinco microesferas protegidas por perlas de polimetacrilato de metilo y se denominan B1-5. g Imagen Cryo-FIB en la región objetivo. h Imagen Cryo-CLEM en la región en (g). Las microesferas seleccionadas en (f) se indican en consecuencia. i Fabricación Cryo-FIB de las microesferas objetivo en (h). j Después de la fabricación crio-FIB, se capturó la imagen crio-SEM (señal SE) de la cuadrícula en la región objetivo y se fusionó con la imagen fluorescente en (f). k Imágenes crio-SEM altamente magnificadas (señal SE) de cada laminilla en las posiciones de B1-B5. Las secciones transversales tanto de las microesferas fluorescentes de 1 μm como de las perlas de polimetacrilato de metilo más grandes están claramente resueltas. Y los diámetros de las secciones transversales de las microesferas fluorescentes se pueden medir directamente a partir de las imágenes SEM y la distribución estadística resultante de los diámetros se representa en (l). Consulte los Datos complementarios 5 para obtener imágenes crio-FIB sin procesar de (g), (h) y (j).

En nuestra segunda medición (Fig. 3f-l), para imitar el procedimiento experimental real de molienda crio-FIB objetivo, vitrificamos la solución mixta de microesferas azules de 1 μm (430/465 nm, F13080, Thermo Fisher Scientific Corp., OR ) y perlas de polimetacrilato de metilo de 5 μm (PMMA5, Kai New Materials Ltd., CN) directamente en la rejilla EM. Con el blindaje de grandes perlas de polimetacrilato de metilo, se incrustaron muchas microesferas azules en el hielo vitrificado, imitando el objetivo fluorescente incrustado en la celda vitrificada. Luego seleccionamos cinco microesferas integradas (B1-5 en la Fig. 3f) para probar la precisión del fresado crio-FIB objetivo. Primero, utilizamos las microesferas azules no incrustadas que eran discernibles en la imagen crio-FIB para correlacionar las imágenes crio-SIM 3D y crio-FIB 2D (Fig. 3g, h). La imagen de correlación (Fig. 3h) mostró que las microesferas seleccionadas eran irreconocibles y estaban exactamente cerca de las grandes perlas de polimetacrilato de metilo según las señales fluorescentes correlacionadas. Luego se realizó el fresado crio-FIB en estas posiciones objetivo, respectivamente (Fig. 3i, j). Luego se obtuvieron imágenes de la criolamela resultante con un espesor de ~ 200 nm mediante SEM con gran aumento (Fig. 3k). Se midieron los diámetros de las microesferas objetivo fresadas (Fig. 3l y Fig. 6 complementaria), lo que resultó en una medición de diámetro promedio de 908 ± 106 nm (Datos complementarios 3). En comparación con la medición estadística de los diámetros de las microesferas azules en condiciones criogénicas (Figura complementaria 7 y Datos complementarios 4), que mostró que el diámetro promedio de las microesferas azules fue de 997 ± 32 nm, la precisión del fresado crio-FIB objetivo en nuestro el flujo de trabajo es al menos menor que 100 nm.

En particular, encontramos que la distribución de las microesferas fluorescentes en la dirección y (perpendicular a la dirección de escaneo FIB) y la precisión de la determinación de las coordenadas z de las microesferas son factores clave que afectan la precisión de la correlación (ver también la Nota complementaria 1).

Aplicamos nuestro flujo de trabajo crio-CLEM basado en HOPE-SIM para estudiar sistemas biológicos reales. La primera prueba fue apuntar a las mitocondrias de las células HeLa que se tiñeron con MitoTracker Red CMXRos (Invitrogen M7512, Thermo Fisher Scientific Corp., OR.). Con la resolución mejorada de crio-SIM, las mitocondrias se pueden resolver y separar bien en la imagen fluorescente, y la mitocondria seleccionada se puede apuntar con precisión mediante 3D-View para el fresado crio-FIB, que posteriormente fue capturado por crio-ET (Fig. .1).

Además de apuntar a las mitocondrias, intentamos una segunda prueba con implicaciones más biológicas para visualizar el ensamblaje del virus in situ a partir de células infectadas. Herpesviridae es una gran familia que consta de herpesvirus alfa, beta y gamma. El gammaherpesvirus 68 murino (MHV-68), al igual que los gammaherpesvirus humanos, puede establecer una infección productiva de fibroblastos o líneas celulares epiteliales derivadas de especies de mamíferos y, por lo tanto, es un sistema modelo para el estudio de los mecanismos patogénicos asociados con la infección por gammaherpesvirus humano. La maduración del herpesvirus incluye cuatro etapas: formación de la cápside en el núcleo, envoltura primaria y paso a través de la membrana nuclear, tegumentación y envoltura secundaria en el citoplasma y salida de la célula44. Utilizando microscopía electrónica de transmisión convencional de secciones incluidas en plástico, estudios previos observaron "depósitos de tegumento" en el citoplasma de células BHK-21 infectadas con MHV-68, donde las cápsides se acumulan para adquirir una serie de proteínas del tegumento45.

Aquí, etiquetamos la proteína de la cápside ORF65 de MHV-68 con la etiqueta fluorescente mCherry (canal rojo) y utilizamos nuestro flujo de trabajo crio-CLEM basado en HOPE-SIM para investigar la estructura nativa in situ del "depósito de tegumento" en ORF65-mCherry. Células BHK-21 infectadas con MHV-68, que se cultivaron y vitrificaron en la rejilla EM (Fig. 4a-c). Utilizamos microesferas azules de 1 μm como marcadores fiduciales (canal verde) para correlacionar imágenes crio-SIM 3D y crio-FIB 2D en 3D-View e identificamos la ubicación del depósito del tegumento en el citoplasma (Fig. 4d). Luego, realizamos un fresado crio-FIB específico del sitio y preparamos crio-láminas con un espesor de 200 nm (Fig. 4e). Tomamos una micrografía crio-SEM de bajo aumento de la crio-lamela, la fusionamos con la imagen crio-SIM correspondiente y confirmamos la señal fluorescente de las partículas virales objetivo ubicadas en la crio-lamela (Fig. 4f). Luego, la crio-lamela se transfirió para obtener imágenes crio-EM (Fig. 4g) y reconstrucción crio-ET con un gran aumento, donde encontramos partículas virales objetivo que estaban bajo tegumentación (Fig. 4h y Películas complementarias 3 y 4).

a Imagen de campo brillante del cuadrado objetivo. b La proyección z de la imagen fluorescente HOPE-SIM. Microesferas verdes fluorescentes. Rojo, virus MHV-68. c La imagen fluorescente en (b) se fusiona con la imagen de campo brillante en (a) para mostrar la ubicación de la señal objetivo. d Correlación 3D entre las imágenes crio-SIM y crio-FIB. e Imagen Cryo-FIB del cuadrado objetivo después de la fabricación. f Imagen crio-SEM del cuadrado objetivo después de la fabricación, que se fusiona con la proyección z de la imagen crio-SIM en (b). g Micrografía Cryo-EM (× 3600) de la crio-lamela en (f). La región objetivo marcada por el rectángulo rojo se somete a reconstrucción crio-ET en (h) con un aumento de ×64 000, donde un corte de la tomografía muestra diferentes tipos de partículas virales que están bajo tegumentación. Consulte los Datos complementarios 6 para obtener imágenes crio-FIB sin procesar de (d) y (e), imagen crio-SEM sin procesar de (f) e imagen crio-EM sin procesar de (g).

Para la tercera prueba, probamos un objetivo más desafiante: el centriolo humano en las células HeLa. Los centriolos humanos están estrechamente relacionados con la tumorigénesis y múltiples enfermedades hereditarias46,47. Sólo hay uno o dos pares de centríolos en cada célula de mamífero, lo que limita en gran medida el estudio in situ de sus estructuras sin un flujo de trabajo crio-CLEM eficiente. Aquí, utilizamos células HeLa que expresan el dominio PACT (orientación centrosomal de pericentrina-AKAP450) marcado con mCherry, que es uno de los componentes del centrosoma, para apuntar y visualizar el centríolo humano mediante crio-ET (Fig. 5). Nuevamente, utilizamos microesferas azules de 1 μm como marcadores fiduciales (canal verde) para correlacionar las imágenes crio-SIM 3D y crio-FIB 2D en 3D-View e identificar la ubicación de los centrosomas (Fig. 5a-d), que frecuentemente Apareció como dos puntos de fluorescencia en las imágenes crio-SIM (Fig. 5c). Luego realizamos un fresado crio-FIB específico del sitio para preparar las criolamelas objetivo con un espesor de ~ 200 nm (Fig. 5e, f), que posteriormente se verificó mediante crio-EM (Fig. 5g, h y Fig. complementaria. 8). Una reconstrucción adicional mediante crio-ET reveló la estructura 3D in situ de un par de centriolos perpendiculares (Fig. 5i-m y películas complementarias 5-8). En particular, de acuerdo con nuestras estadísticas actuales, logramos fabricar 19 crio-lamelas gruesas a partir de 19 células vitrificadas y las devolvimos para la verificación crio-SIM y encontramos que 16 crio-lamelas retenían la señal de fluorescencia de los centrosomas objetivo (Fig. 9 complementaria y Suplementaria). Datos 9), lo que sugiere una alta tasa de éxito en la focalización.

Una imagen de campo brillante del cuadrado objetivo se fusiona con la proyección z de la imagen fluorescente HOPE-SIM en (b), donde las microesferas (verde) están bien distribuidas y los centrosomas marcados con fluorescencia (rojo) están bien resueltos. Se seleccionan cuatro conjuntos (C1-4) de centrosomas C1-4 para la posterior fabricación de crio-FIB. c Vista ampliada de los cuatro conjuntos de centrosomas en (b). d Correlación 3D entre imágenes HOPE-SIM y crio-FIB para localizar las posiciones de los centrosomas seleccionados. e Imagen Cryo-FIB después de la fabricación en las posiciones de C1-4 en (d). La crio-lamela C3 indicada por el rectángulo discontinuo azul se somete a la recopilación de datos crio-ET. f Imagen crio-EM de bajo aumento (× 155) de las criolamelas en (e). g Micrografía crio-EM de la crio-lamela C3 con un aumento de ×4300. h Micrografía crio-EM (× 8700) de la crio-lamela C3 en la región del cuadrado rojo en (g). La región objetivo marcada por el cuadrado blanco se somete a la recopilación y reconstrucción de datos crio-ET. i Un corte de la tomografía (×53 000) de la región objetivo, que muestra los centríolos objetivo, uno en la vista superior y otro en la vista lateral. j – m Estructura 3D in situ del centríolo en células HeLa con diferentes vistas, (j) superior, (k) inferior, (l) lateral y (m) transversal. La estructura está segmentada usando EMAN261 y renderizada en Chimera62. Los túbulos tripletes se muestran en amarillo y las estructuras internas de armazón se muestran en rosa. Cabe señalar que esta estructura se derivó de otra tomografía (× 26 000) de criolamela con un espesor de ~ 300 nm. Consulte los Datos complementarios 7 para obtener imágenes crio-FIB sin procesar de (d) y (e), y una imagen crio-EM sin procesar de (f).

El estudio estructural in situ de macromoléculas en su contexto celular nativo mediante crio-ET se ha convertido en una nueva frontera de la biología estructural. Posteriormente, ha aumentado la demanda de mejorar el flujo de trabajo general, desde la preparación de muestras y la recopilación de datos hasta el análisis de imágenes. Además, el protocolo actual de correlación de imágenes entre crio-FM, crio-FIB y crio-ET debe mejorarse aún más con mayor eficiencia y precisión. La crio-FM13,21,22 de campo amplio comúnmente utilizada o la microscopía confocal crio-Airyscan (CACM)12 desarrollada recientemente tienen una resolución limitada y carecen de resolución 3D, lo que dificulta la precisión de la correlación con la imagen 2D posterior de crio-FIB. La microscopía de fluorescencia de superresolución en condiciones criogénicas basada en el principio de localización activada por fotones se ha desarrollado con una resolución de escala nanométrica;40,49 sin embargo, la alta potencia de iluminación que se requiere aumenta el alto riesgo de desvitrificación. En comparación con la microscopía de fluorescencia de campo amplio convencional, SIM permite una mejora doble en la resolución limitada por difracción en tres dimensiones28,34,35,36,37,38 con una potencia de iluminación relativamente baja (10–100 mW cm-2). La naturaleza de campo amplio del SIM lo hace eficiente desde el punto de vista luminoso y desacopla la velocidad de adquisición del tamaño del campo de visión lateral, lo que significa que son posibles altas velocidades de fotogramas en grandes volúmenes37. Además, SIM se puede combinar con un algoritmo de imágenes de superresolución38 o una estrategia progresiva de superresolución de aprendizaje profundo50,51 para lograr una resolución más alta. Por lo tanto, crio-SIM proporciona una solución prometedora para mejorar la precisión del flujo de trabajo crio-CLEM actual.

En este estudio, desarrollamos un flujo de trabajo crio-CLEM basado en HOPE-SIM incorporando el módulo SIM en nuestro sistema HOPE previamente desarrollado para permitir crio-FM 3D de alta resolución, actualizando el sistema de vacío original para eliminar aún más la contaminación/deposición de hielo. y escribir el software HOPE-SIM View/3D-View para controlar el hardware y realizar la correlación de imágenes de forma semiautomática. Demostramos que nuestro sistema HOPE-SIM puede lograr imágenes crio-SIM con una resolución de ~200 nm en la dirección lateral y ~500 nm en la dirección z. Estos resultados son mejores que los modos convencionales de crio-FM y deconvolución de campo amplio. Verificamos la precisión de la correlación entre crio-SIM y crio-FIB como 110 nm, lo cual es lo suficientemente bueno para realizar una fabricación crio-FIB precisa y específica del sitio de crio-lamelas con un espesor de ~ 200 nm. Aplicamos nuestro flujo de trabajo crio-CLEM basado en HOPE-SIM para apuntar con éxito a las mitocondrias teñidas con MitoTracker en células HeLa, visualizar viriones MHV-68 etiquetados con mCherry bajo tegumentación en células BHK-21 infectadas y obtener una tomografía de los centríolos humanos en HeLa. células. La alta tasa de éxito al apuntar a los centriolos humanos sugiere la solidez y precisión de nuestro flujo de trabajo crio-CLEM.

En comparación con el sistema crio-CLEM no integrado publicado y disponible comercialmente (Tabla complementaria 1), nuestro sistema crio-CLEM basado en HOPE-SIM ofrece numerosas ventajas, incluido el uso de una cámara de alto vacío con una lente objetivo de alta NA integrada. mantenido a temperatura ambiente y un sistema anticontaminación mejorado para permitir imágenes crio-FM de alta resolución durante mucho tiempo sin la preocupación de que la lente se congele/dañe y de que se forme hielo; Con la punta del soporte especialmente diseñada para acomodar el AutoGrid y el crio-multi-soporte comercial, la muestra criogénica se puede transferir eficientemente de crio-FM a crio-FIB y luego a crio-ET sin tocar la rejilla directamente, lo que minimiza el riesgo de daños a la muestra durante la transferencia de la misma. Con imágenes crio-SIM y el algoritmo de correlación 3D, podríamos lograr microscopía de fluorescencia de alta resolución, especialmente con una mejor resolución en la dirección z, y luego realizar una correlación 3D precisa con imágenes 2D crio-FIB, lo que resulta en criometría precisa para un sitio específico. -Fresado FIB.

Cabe señalar que, además de los sistemas crio-CLEM no integrados, recientemente se ha desarrollado otro concepto crio-CLEM, que integra el sistema de imágenes de fluorescencia en la cámara crio-FIB/crio-SEM. Estos sistemas integrados incluyen PIE-Scope22, iFLM52, METEOR53 y el microscopio de tres haces coincidente54, así como los recientemente publicados ELI-TriScope55 y CLIEM56 por nosotros y nuestros colegas. Además de evitar la transferencia de muestras durante las microscopías para minimizar los riesgos de daño de las muestras y contaminación por hielo, estos sistemas también pueden lograr imágenes correlativas sin la necesidad de marcadores fiduciales fluorescentes después de una precalibración adecuada54,55,56, lo que aumenta significativamente el flujo de trabajo crio-CLEM. eficiencia. Nuestro ELI-TriScope55 proporciona otra ventaja única para monitorear la fluorescencia del objetivo durante el fresado crio-FIB, minimizando así el efecto fuera del objetivo inducido por el fresado crio-FIB y acompañado de la deformación de la crio-lamela. El diseño de nuestro sistema HOPE-SIM es totalmente compatible con nuestro sistema ELI-TriScope al utilizar el mismo multisoporte criogénico para transferir muestras criogénicas, lo que proporciona una solución completa para el futuro experimento crio-CLEM.

En general, nuestro flujo de trabajo crio-CLEM basado en el sistema HOPE-SIM proporciona una solución eficiente no integrada para lograr una fabricación crio-FIB objetivo precisa de crio-lamelas listas para el estudio crio-ET específico del sitio. Nuestro sistema HOPE-SIM es versátil y se puede adaptar a varios microscopios electrónicos y de fluorescencia mediante la utilización de platinas, soportes criogénicos y cartuchos adecuados. En el futuro, además de una mayor integración con nuestro sistema ELI-TriScope55 en una dirección, también actualizaremos nuestro sistema HOPE-SIM utilizando la estrategia progresiva de superresolución de aprendizaje profundo para lograr una resolución más alta y actualizaremos el software 3D-View para lograr resultados completamente automáticos. correlación de imágenes, lo que genera una solución no integrada más eficiente y precisa de fresado crio-FIB específico del sitio.

Se utilizaron rejillas indexadas esterilizadas con luz ultravioleta con un cuarto recortado (rejillas D, T11012SSF, TIANLD, China) para el cultivo de células HeLa y BHK-21.

Se sembraron células HeLa marcadas con MitoTracker o que expresaban mCherry fusionadas al dominio PACT (pericentrina-AKAP450 centrosomal targeting)48 en rejillas D esterilizadas con luz ultravioleta y se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) completo suplementado con 10% de suero bovino fetal, 1% penicilina y estreptomicina. Después de 48 h de cultivo, las rejillas se sometieron a una posterior congelación por inmersión.

Las células BHK-21 se cultivaron en DMEM completo suplementado con suero bovino fetal al 10 %, penicilina al 1 % y estreptomicina. Los medios de cultivo se cambiaron de forma rutinaria cada 2 días reemplazando la mitad del medio antiguo por un medio nuevo. Las rejillas D esterilizadas con luz ultravioleta se colocaron en una placa de cultivo de 12 pocillos antes de la siembra celular (con la película de carbono hacia arriba). Luego, se sembraron células BHK-21. Después de que las células se unieran a las rejillas D, se infectaron con el virus ORF65-mCherry MHV-68 con una multiplicidad de infección (MOI) de 100 durante 1 h. Luego, se retiró el inóculo y se reemplazó con DMEM fresco más suero bovino fetal al 10%. Después de 24 h de infección, las rejillas D se sometieron a congelación profunda.

Específicamente, se utilizaron 1,5 μl de microesferas fluorescentes azules con un diámetro de 1 μm (430/465 nm, F13080, Thermo Fisher Scientific Corp., OR), utilizadas como marcadores para la correlación entre las imágenes crio-SIM 3D y crio-FIB 2D. Se diluyó con PBS en una proporción de 1:400 y se añadió a la rejilla D con el lado donde crecían las células antes de la criovitrificación.

En la Fig. 2a se presenta un diagrama esquemático de la ruta óptica del sistema HOPE-SIM, y en la Fig. 2a complementaria se muestra una imagen de la configuración óptica real. Configuramos un combinador láser de tres láseres con longitudes de onda de 405 nm (50 mW, OBIS 405LX, Coherent), 488 nm (200 mW, SAPPHIRE 488-200 CW, Coherent) y 561 nm (200 mW, SAPPHIRE 561-200 CW, coherente). El rayo láser emitido por el combinador láser pasa a través de un filtro sintonizable acústico-óptico (modulador de amplitud, AOTF, AOTFnC-400.650-TN y controlador MPDS4C-B66-22-74.158-RS, Quanta Tech) y luego se expande hasta un diámetro de 25 mm. Luego, el haz pasa a través de un modulador de fase y ángulo que consta de un cubo divisor de haz polarizador (PBS, CCM1-PBS251, Thorlabs), una placa de media onda acromática (HWP, AHWP10 M-600, Thorlabs) y una placa ferroeléctrica. Modulador de luz espacial (SLM, QXGA-3DM, Forth Dimension Displays) para generar iluminación modelada con tres orientaciones alternativas (Figura complementaria 2b). Estos tres haces estampados pasan a través de otra lente y se modulan en el plano de difracción mediante una máscara personalizada que consiste en un disco a prueba de luz con una apertura de siete orificios. Sólo se seleccionan para pasar difracciones de orden 0 y ±1 para cada haz modelado. Los tres haces modelados finalmente se enfocan en el plano focal posterior de la lente del objetivo (Figura complementaria 2c). Después de pasar a través de la lente del objetivo, se generan patrones de interferencia (franja de Moiré) con cinco fases (0, π/5, 2π/5, 3π/5, 4π/5) y tres ángulos de rotación (0°, 60° y 120°). °). El período, la orientación y la fase relativa de este patrón de excitación se pueden ajustar ajustando la configuración de SLM. Para cada orientación y fase del patrón de excitación, la lente del objetivo recoge las señales de fluorescencia resultantes y las registra en una cámara sCMOS de alta sensibilidad (Prime 95B, Photometrics). Todas las lentes utilizadas en el sistema se eligen como dobletes acromáticos. Se utilizan aperturas ópticas y máscaras para mejorar la calidad de la iluminación.

Se recopilaron series de datos sin procesar de 3D-SIM utilizando una lente de objetivo seco (NA 0,9) con un incremento de 250 nm a lo largo del eje z. Para cada corte z, se adquirieron 15 imágenes para cinco fases y tres orientaciones para satisfacer el muestreo de Nyquist-Shannon. Cada imagen sin procesar tiene un tamaño de píxel de 120 nm y un campo de visión (FOV) de 1200 × 1200 píxeles. Luego, la pila final de imágenes sin procesar tiene un tamaño de vóxel de 120 × 120 × 250 nm. El tiempo de exposición de cada imagen sin procesar depende de la intensidad general del fluoróforo y, normalmente, todo el conjunto de datos se recopiló en un tiempo promedio de 5 a 10 minutos para capturar un campo de visión con la profundidad z requerida de ~ 20 μm.

Las reconstrucciones de imágenes SIM se realizaron utilizando SoftWoRx 6.1.1 (GE Healthcare) con las siguientes configuraciones: funciones de transferencia óptica (OTF) específicas del canal, una constante de filtro Wiener de 0,010, un fondo con intensidades negativas descartadas y corrección de deriva con respecto a la primer ángulo. Los OTF se generaron a partir de funciones de dispersión puntual (PSF) mediante SoftWoRx 6.1.1, y los PSF del sistema HOPE-SIM a temperaturas criogénicas se midieron utilizando microesferas fluorescentes de 200 nm (405 nm/488 nm/560 nm, Thermo Fisher Scientific Corp. ., O). Para cada corte z, la imagen final reconstruida contiene 2400 × 2400 píxeles con un tamaño de píxel de 60 nm. Se utilizó el software de código abierto SIMcheck43 para verificar el rendimiento del sistema óptico SIM, ajustar parámetros y reconocer artefactos.

Definimos el vector de coordenadas de cada microesfera fluorescente como X = \(\left[\begin{array}{c}x\\ y\\ z\end{array}\right]\); esto proporcionó dos conjuntos de datos de vectores, \({X}_{{SIMi}}(i=1,\ldots ,N)\) y \({X}_{{FIBi}}(i=1,\ldots , N)\), para las microesferas fluorescentes correspondientes seleccionadas de las imágenes crio-SIM y crio-FIB, respectivamente. El centroide de cada conjunto de datos se puede calcular de la siguiente manera:

En este estudio, definimos la operación de rotación R(\(\theta\)) de tres ángulos de Euler (\({\theta }_{x}\), \({\theta }_{y}\), \ ({\theta }_{z}\)) de la siguiente manera:

Las coordenadas 3D de las microesferas fluorescentes en el volumen crio-SIM se pueden traducir a coordenadas 2D en el plano de coordenadas de la imagen crio-FIB de la siguiente manera:

donde P (z) es la proyección a lo largo de la dirección z y se utiliza el sistema de transformación de rotación Z – Y – X.

Además, las coordenadas de las microesferas fluorescentes en la imagen crio-FIB se traducen de la siguiente manera:

Según las Ecs. (6) y (7), la desviación de la correlación entre los conjuntos de datos crio-SIM y crio-FIB se puede definir de la siguiente manera:

Usando los métodos de mínimos cuadrados, el ángulo de Euler optimizado \(({{\theta }_{x},\theta }_{y}\,{,\theta }_{z})\) se puede resolver para minimizar el desviación de correlación XSD. Finalmente, los datos del volumen 3D crio-SIM se pueden proyectar y fusionar con la imagen crio-FIB 2D usando la ecuación. (6). Las posiciones de destino definidas en la imagen crio-SIM se pueden ubicar con precisión en la imagen crio-FIB.

Las microesferas fluorescentes claramente visibles alrededor de la célula objetivo se seleccionaron manualmente a partir de las imágenes crio-SIM 3D y crio-FIB. La distribución de las microesferas fluorescentes seleccionadas debe estar en ambos lados de la celda, especialmente en la dirección y, para una mejor precisión de la correlación. Primero se determinaron los centros de las microesferas en el plano XY. Para optimizar aún más la correlación entre dos imágenes correlativas, la altura Z de las microesferas fluorescentes podría ajustarse manualmente de acuerdo con las formas de las microesferas de fluorescencia (que se muestran en la película complementaria 2). Para la imagen crio-FIB, el centro de la microesfera fue difícil de reconocer porque la microesfera normalmente estaba incrustada en el hielo y aparecía como una protuberancia. La posición de la parte superior de la protuberancia representa la posición del borde de la microesfera. Por lo tanto, con este conocimiento, el centro de la microesfera en la imagen crio-FIB podría determinarse encontrando la posición que estaba a la mitad del diámetro de la microesfera desde la parte superior de la protuberancia a lo largo de la dirección y (dirección de fresado FIB). Después de la primera ronda de correlación, algunas microesferas con grandes desviaciones fueron eliminadas debido a errores importantes al determinar sus centros. Luego, los parámetros de correlación se actualizaron optimizando la posición del eje z de cada microesfera. Todas estas operaciones de correlación de imágenes se realizaron en 3D-View (Figura complementaria 5).

Las crio-lamellas se prepararon mediante molienda crio-FIB utilizando el microscopio FEI Helios NanoLab 600i o Aquilos-2 FIB-SEM (Thermo Fisher Scientific Corp., OR). Se seleccionaron células diana con señales fluorescentes claras de acuerdo con el mapa de correlación anterior. Luego, la rejilla se recubrió con una capa organometálica de platino durante 5 s a una distancia de trabajo de 5 mm. Se obtuvieron criolamelas con un espesor de ~ 200 nm moliendo gradualmente utilizando una corriente de haz de Ga+ de 4 pasos de 0,43 nA, 0,23 nA, 80 pA y 40 pA en un ángulo de etapa de 13 a 22 °.

Las crio-lamelas se cargaron en un FEI Titan Krios G3i (Thermo Fisher Scientific Corp., OR.) que estaba equipado con una cámara Gatan GIF K2 4k × 4k (Gatan, Inc., Warrendale, PA) y operado a 300 kV en Modo de dosis baja. Las series de inclinación se recopilaron bidireccionalmente con el software SerialEM57 utilizando un rango de inclinación de −60° a 40° en intervalos de 2°, aumento nominal de ×33 000 o ×53 000, desenfoque de −4 ~−6 µm y dosis total de ~150 e Å− 2. Las series de inclinación se alinearon y reconstruyeron con un algoritmo de retroproyección ponderada usando IMOD58 o reconstruidas usando ICON59,60.

La segmentación de imágenes del tomograma de centríolo se realizó con EMAN261 y la representación 3D se realizó con Chimera62.

Todas las mediciones se repitieron al menos tres veces de forma independiente, lo que resultó en resultados similares. Los perfiles estadísticos y las cifras se generaron utilizando LabVIEW, Origin o Excel. El tamaño de la muestra de cada medición se indicó en el artículo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las micrografías sin procesar y los datos estadísticos sin procesar de este estudio se proporcionan como datos complementarios. Las series de inclinación sin procesar y las tomografías reconstruidas están disponibles a pedido.

El programa LabVIEW HOPE-SIM View para controlar el dispositivo depende del hardware y el programa 3D-View para correlación de imágenes es independiente del hardware. Estos dos programas están disponibles en GitHub con el enlace https://github.com/hilbertsun/HOPE-SIM.

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Descargar referencias

Todo el trabajo de crio-CLEM, FIB y ET se realizó en el Centro de Imágenes Biológicas (CBI, http://www.ibp.cas.cn/cbi/), el Instituto de Biofísica (IBP) y la Academia China de Ciencias (CAS). Agradecemos al Dr. Xiaojun Huang, Boling Zhu, Xujing Li, Lihong Chen por su ayuda con la recopilación de datos crio-EM y al Sr. Zeyang Li y la Sra. Lulu Qin por su ayuda con la fabricación crio-FIB. También nos gustaría agradecer al Dr. Fulin Wang y al Prof. Jianguo Chen de la Universidad de Pekín por su amabilidad al proporcionarnos células HeLa que expresan mCherry-PACT, al Prof. Wei Ji y al Prof. Dong Li del IBP por su amable ayuda con la microscopía óptica, y La Sra. Ziyan Wang y el Dr. Yun Zhu del IBP por su amable ayuda con el procesamiento de datos crio-ET. Este trabajo fue igualmente apoyado por subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2017YFA0504700 a GJ), el Programa de Investigación de Prioridad Estratégica de la Academia China de Ciencias (XDB37040102 a FS) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31830020 a FS) . Además, este trabajo fue apoyado por el Programa de Innovación Tecnológica de la Academia de Ciencias de China (29Y8CZ021001 a GJ), el Proyecto de Personal de Soporte Técnico Clave de CAS (29Y9CQ041 a GJ) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31801199 a SL, 31801201 a XJ y 81630059 a HD).

Centro de Imágenes Biológicas, Instalaciones Básicas para la Ciencia de las Proteínas, Instituto de Biofísica, Academia China de Ciencias, 100101, Beijing, China

Shuoguo Li, Xing Jia, Tongxin Niu, Xiaoyun Zhang, Chen Qi, Wei Xu, Fei Sun y Gang Ji

Laboratorio Nacional Clave de Biomacromoléculas, Instituto de Biofísica, Academia China de Ciencias, 100101, Beijing, China

Shuoguo Li y Fei Sun

Universidad de la Academia de Ciencias de China, 100049, Beijing, China

Shuoguo Li, Hongyu Deng, Fei Sun y Gang Ji

Laboratorio clave de infección e inmunidad de CAS, Instituto de Biofísica, Academia de Ciencias de China, 100101, Beijing, China

Hongyu Deng

Centro CAS para la Excelencia en Biomacromoléculas, Instituto de Biofísica, Academia China de Ciencias, 100101, Beijing, China

Hongyu Deng y Fei Sun

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GJ y FS iniciaron y supervisaron el proyecto. GJ y SL diseñaron y construyeron el sistema HOPE-SIM con la tutoría de WXGJ y escribieron los programas de software. SL realizó los experimentos crio-CLEM y el trabajo crio-ET. XJ, XZ y HD realizaron los experimentos de vitrificación y cultivo celular. XJ, GJ y SL realizaron el trabajo de fabricación de crio-FIB. TN, SL, XJ y CQ realizaron el procesamiento de imágenes. SL, GJ y FS analizaron los datos y escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Fei Sun o Gang Ji.

Los autores declaran los siguientes intereses en competencia: A partes de este estudio (sistema HOPE-SIM) se les ha asignado una patente de invención china (CN202110919044.4).

Communications Biology agradece a Gong-Her Wu y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal: Gene Chong. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Li, S., Jia, X., Niu, T. et al. HOPE-SIM, un sistema de microscopía de fluorescencia con iluminación crioestructurada para tomografía crioelectrónica dirigida con precisión. Común Biol 6, 474 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04850-x

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Recibido: 19 de septiembre de 2022

Aceptado: 18 de abril de 2023

Publicado: 29 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04850-x

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