La plataforma modular automatizada de cultivo de células de microfluidos reduce el estrés glucolítico en los organoides de la corteza cerebral

Feb 04, 2024

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 20173 (2022) Citar este artículo

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Los sistemas de órgano en un chip combinan microfluidos, biología celular e ingeniería de tejidos para cultivar modelos in vitro 3D específicos de órganos que recapitulan la biología y fisiología de sus homólogos in vivo. Aquí, hemos desarrollado una plataforma multiplex que automatiza el cultivo de organoides individuales en microambientes aislados a velocidades de flujo de medios definidas por el usuario. Los flujos de trabajo programables permiten el uso de múltiples depósitos de reactivos que pueden aplicarse para dirigir la diferenciación, estudiar variables temporales y cultivar cultivos a largo plazo. Aquí se describen nuevas técnicas en la fabricación de chips de polidimetilsiloxano (PDMS) que permiten funciones en los planos superior e inferior de un único sustrato de PDMS. El análisis de secuenciación de ARN (RNA-seq) de cultivos organoides automatizados de corteza cerebral muestra beneficios en la reducción del estrés glucolítico y del retículo endoplásmico en comparación con los cultivos celulares in vitro convencionales.

El cultivo celular ha sido un modelo principal para estudiar las enfermedades y el desarrollo humanos durante más de 70 años desde el aislamiento de células HeLa de una biopsia de cáncer de cuello uterino humano1,2. Utilizados originalmente como vehículo para investigar virus, los protocolos de cultivo de células humanas se optimizaron para un crecimiento rápido y sencillo para producir grandes cantidades de material. Si bien los protocolos de cultivo de tejidos han avanzado, particularmente en la reducción de muchos componentes de los medios, muchas de estas recetas originales siguen vigentes. Todavía hay mucho margen de mejora para que los protocolos de cultivo de tejidos imiten las concentraciones, el suministro y la eliminación de nutrientes fisiológicos. Los microfluidos automatizados nos permiten ir más allá de los protocolos tradicionales al alimentar a velocidades y precisión que no son factibles manualmente.

Los avances recientes en células madre y biología del desarrollo han generado modelos más precisos que se asemejan a aspectos del tejido humano primario3,4. Las células madre embrionarias humanas (hES) y las células madre pluripotentes inducidas (iPS), denominadas colectivamente células madre pluripotentes (PSC), tienen el potencial de diferenciarse en la mayoría de los tipos de células del cuerpo, y los protocolos aprovecharon esto para generar modelos de cultivo en 3D. para tejidos humanos, incluidos el cerebro, el intestino, el hígado y la mama5,6. Estos cultivos celulares autoensamblados y específicos de órganos, llamados organoides, se utilizan ampliamente como modelos in vitro en la investigación del desarrollo, la patogénesis y la medicina7,8,9. Los organoides imitan las características funcionales clave de la fisiología de su homólogo de tejido primario con mayor precisión que los cultivos celulares 2D6. Más allá de su uso como modelos in vitro, los organoides también se están explorando para aplicaciones en medicina regenerativa y atención médica como tejido para implantes5. A medida que la tecnología abre nuevas fronteras, existe una creciente necesidad de mejores métodos para cultivar, controlar y analizar cultivos de organoides. Es necesario reducir la brecha entre los cultivos in vitro y el tejido primario. Esfuerzos como los avances que se muestran aquí aprovechan los microfluidos de precisión, la automatización robótica y la detección sin contacto para permitir un cultivo celular robusto y reproducible optimizado para la fidelidad del tejido.

La capacidad de los organoides derivados de PSC para autoensamblarse y generar muchos tipos de células específicas de tejido los hace particularmente útiles para modelar tejidos y sistemas complejos. El cerebro contiene una de las complejidades más altas del cuerpo humano y los investigadores pueden generar modelos de alta calidad de diferentes regiones del cerebro con tecnología organoide. Los organoides cerebrales son una forma de organoide cerebral que modela la fisiología de la corteza cerebral y contiene muchos tipos de células y subregiones específicas de la corteza10. Estos organoides se utilizan ampliamente para investigaciones sobre el desarrollo cerebral prenatal11,12,13, patologías cerebrales14 y pruebas terapéuticas15. Los organoides cerebrales crecerán hasta unos pocos milímetros de diámetro durante un cultivo prolongado y pueden mantenerse en cultivo indefinidamente16.

La Figura 1 ilustra el proceso de generación de organoides cerebrales humanos mediante la agregación de PSC humanas17,18. La inducción neuronal se logra inhibiendo las vías WNT (IWR1-\(\varepsilon\)) y Nodal/Activina (SB431542) y produce tejido cortical dorsal y ventral. A medida que el desarrollo de organoides avanza a un ritmo similar al desarrollo fetal primario, estos cultivos deben mantenerse durante semanas o meses para observar los tipos de células y estructuras tisulares en etapa tardía. Estos incluyen tipos de células terminalmente diferenciadas, como neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, y la observación de rosetas organizadas localmente compuestas por células madre neurales de la glía radial (Fig. 1B). Los protocolos actuales de organoides cerebrales tienen limitaciones en cuanto a rendimiento, consistencia y confiabilidad, así como problemas de salud, mostrando signos característicos de estrés celular19,20. Es probable que el fenotipo del estrés celular sea multifactorial; sin embargo, muchos factores pueden resultar del cultivo celular tradicional. El ritmo de los cambios manuales de medios (a menudo una vez cada 1 a 3 días) provoca cambios erráticos en la disponibilidad de nutrientes y la acumulación de metabolitos tóxicos. Al alimentarse fuera de la incubadora, las células experimentan temperaturas más frías y una reducción del dióxido de carbono disuelto, lo que conduce a un ambiente más alcalino. La automatización del laboratorio es cada vez más frecuente en las ciencias biológicas para reducir el efecto de estas variables no controladas y aumentar la cantidad y calidad de los experimentos, lo que permite un mantenimiento sencillo a largo plazo con requisitos manuales mínimos.

Descripción general del protocolo de generación de organoides cerebrales humanos. (A) Las células madre pluripotentes humanas se expanden en cultivos 2D tradicionales, se disocian, se agregan en micropocillos y se maduran en cultivos organoides 3D utilizando condiciones de medios definidas para promover la diferenciación del tejido de la corteza cerebral. En este estudio, el día 12 después de la agregación, los organoides se mantuvieron en suspensión y se mantuvieron manualmente (flecha negra) o se transfirieron a pocillos individuales de un chip de microfluidos y se mantuvieron en automatización (flecha azul). (B) Imágenes de cultivos de organoides cerebrales. Las imágenes de campo brillante con aumento bajo (izquierda) y alto (centro) en condiciones de cultivo estándar muestran la morfología y heterogeneidad de los organoides. Tinciones de inmunofluorescencia en la semana 5 para PAX6 (células progenitoras de la glía radial, verdes), CTIP2 (BCL11B) (magenta, neuronas de proyección excitadoras), ZO-1 (TJP1) (proteínas blancas de unión estrecha en los pies terminales de la glía radial, superficie apical de las neuronas tubo), muestran estructuras características en forma de roseta en forma de zona ventricular con glía radial rodeada de neuronas. Núcleos teñidos con DAPI (azul). (C) Imagen del chip de microfluidos PDMS. El chip de cultivo celular personalizado, modelado a partir de una placa estándar de 24 pocillos, alberga organoides para experimentos automatizados.

En el cultivo celular convencional, dispensar, mover y eliminar líquido son las acciones necesarias en todos los protocolos. Por lo tanto, la manipulación de líquidos y el almacenamiento adecuado de reactivos líquidos son características clave para automatizar este proceso. Las tecnologías actuales de manipulación de líquidos se clasifican en términos generales en dos categorías: microfluidos digitales y de flujo continuo21. Los sistemas de flujo continuo dependen del flujo de líquido en estado estacionario generado por bombas de presión, mecánicas o electrocinéticas. Con flujo constante, estos sistemas ofrecen un alto control de velocidad y homogeneidad; sin embargo, son menos flexibles para manipulaciones fluidas complejas y difíciles de escalar. Los sistemas de canales cerrados derivados del flujo continuo son intrínsecamente de difícil acceso, requieren gestión de gases atrapados y no escalan bien porque los parámetros que gobiernan el flujo en cualquier ubicación dependen de las propiedades de todo el sistema.

Por el contrario, los microfluidos basados ​​en gotas o de flujo segmentado controlan volúmenes discretos, lo cual es conveniente para la manipulación de gotas22, la mezcla, la encapsulación, la clasificación, la detección y los experimentos de alto rendimiento23. En combinación con válvulas, los microfluidos basados ​​en gotas pueden realizar la mayoría de las operaciones lógicas con las gotas para clasificarlas, fusionarlas y dividirlas. El polidimetilsiloxano (PDMS) es el material más común para fabricar dispositivos de microfluidos debido a su bajo costo, versatilidad en la creación de prototipos y alta permeabilidad a los gases24. Los microfluidos basados ​​en gotas han creado muchas oportunidades de control que son imposibles o poco prácticas en la práctica manual, como programar la frecuencia de alimentación. Dentro de ambas tecnologías, existen variedades de enfoques con y sin contacto25. Los manipuladores de líquidos de contacto requieren una punta que contenga líquido para llegar al sustrato, similar al pipeteo pero con mayor precisión y control. Los manipuladores de líquidos sin contacto manipulan las presiones y velocidades de los fluidos para controlar el flujo. Ambas tecnologías han avanzado a volúmenes ultrabajos (nanolitros) y caudales ultrabajos (microlitros por hora).

Los organoides comúnmente se cultivan en lotes con varios organoides suspendidos en pocillos individuales de una placa. Las condiciones compartidas en un único pozo respaldan la coherencia de los lotes; sin embargo, al aumentar el número de variables en un experimento, como uno con múltiples genotipos, el rendimiento se vuelve un desafío. Además, las placas multipocillos no son adecuadas para controlar las condiciones dinámicas ni generar gradientes de concentración en los medios. Por el contrario, los chips de microfluidos como cámaras de cultivo organoides permiten un control preciso de las condiciones ambientales con alta resolución espaciotemporal26,27. Las diluciones en serie pueden lograr gradientes automatizados y el flujo volumétrico robótico puede gestionar de manera eficiente experimentos de alto rendimiento. La elección del dispositivo para la automatización del laboratorio debe considerar el uso, la flexibilidad y el costo. Teniendo en cuenta el microambiente del cultivo celular, un sistema sin contacto similar al desarrollado aquí ofrece ventajas clave para mantener la homeostasis de las concentraciones de nutrientes, reducir la acumulación de subproductos metabólicos y generar fuerzas de corte más similares a las condiciones in vivo.

Aquí desarrollamos una plataforma de microfluidos sin contacto basada en PDMS con alimentación segmentada para automatizar el cultivo celular prolongado. La plataforma se puede configurar para muchos protocolos de organoides y ensayos de gradiente. La interfaz de la plataforma permite la integración con otros instrumentos de investigación, como un sistema de imágenes en incubadora a través del Internet de las cosas. Evaluamos esta plataforma probando su capacidad para apoyar el crecimiento y desarrollo de organoides de la corteza cerebral humana.

Desarrollamos una plataforma automatizada de cultivo celular de microfluidos para optimizar el crecimiento de organoides 3D, la plataforma "Autocultura". El sistema consta de seis módulos vinculados (Fig. 2): (1) refrigerador con depósitos de reactivos (p. ej., medios frescos), (2) bomba de jeringa, válvulas de distribución e interfaz de control, (3) depósitos de recolección de medios acondicionados en almacenamiento en frío , (4) un bus en serie de microfluidos que interactúa con una incubadora de cultivo celular y (5) un chip organoide de microfluidos multiplexado que (6) inmoviliza los organoides dentro de su recipiente de microambiente (1 de 24 pocillos). Para alimentar a los organoides, cada pozo individual cuenta con el servicio de un controlador de fluidos; el controlador elimina los medios gastados mediante aspiración a un recolector en almacenamiento en frío y luego repone el recipiente con medios nuevos a intervalos programables.

Cada uno de los 24 pozos de este sistema es un experimento separado y aislado con un tubo de entrada, un tubo de salida y un depósito de recolección dedicados. El programa de alimentación de cada pozo es totalmente personalizable en cuanto a velocidad y medios para aumentar la flexibilidad de la experimentación. Se puede programar un rango de 5 a 1000 \(\upmu \hbox {L}\) alícuotas de 3 depósitos de medio/reactivo para cualquier pozo. También se pueden utilizar en combinación depósitos de medio/reactivo. Por diseño, cada pocillo forma un circuito fluídico que mantiene el aislamiento de los otros circuitos en la placa (ver "Métodos"). Una placa completa de 24 pocillos se repara en 72 segundos, y el tiempo entre inyecciones de fluido puede ser cualquier duración (por ejemplo, cada hora, dos veces al día, cada dos días, etc.). Los medios condicionados se pueden recuperar para análisis molecular sin alterar el cultivo en ningún momento durante o después del experimento. Los medios acondicionados tomados para la recolección se separan de los cultivos mediante una fase de aire en los canales fluídicos de salida para mitigar el riesgo de infección que puede ocurrir debido al medio inactivo en las líneas. Después del experimento, los organoides se recuperan para su análisis molecular.

Diseño e implementación de la plataforma automatizada de cultivo de microfluidos. (A) Ilustración de la plataforma automatizada de cultivo de organoides de microfluidos, Autoculture. (B) Imágenes de vista frontal de la Autocultura. (1) Frigorífico con depósitos de reactivos. (2) Bomba de jeringa, válvulas de distribución e interfaz de control. (3) Refrigerador con depósitos de recolección de medios acondicionados. Estos componentes se encuentran en una mesa de laboratorio directamente encima de la incubadora de cultivos celulares. (4) Los tubos de microfluidos ingresan a través de un puerto de la incubadora y se conectan al (5) chip de la placa de pocillos de microfluidos dentro de la incubadora. (6) Diagrama de sección transversal de un solo pozo que contiene un cultivo organoide.

Con estos parámetros de control, placas enteras pueden realizar el mismo flujo de trabajo para generar lotes consistentes de organoides. También se puede valorar un reactivo con un gradiente incremental de concentración del pocillo 1 al 24. Además, se pueden ejecutar múltiples protocolos/programas de alimentación en la placa y cambiar los componentes del medio o los programas de alimentación en varios puntos temporales a lo largo de un experimento.

El Internet de las cosas (IoT) de Amazon Web Services (AWS) proporciona un marco de control conveniente para que múltiples dispositivos comuniquen información e inicien acciones. Con un protocolo de comunicación como Message Queuing Telemetry Transport (MQTT), los sistemas pueden gestionar esfuerzos sincronizados y coordinados de control y adquisición de datos en tiempo real a través de Internet28. La comunicación de sistema a sistema se produce a través de una red de área local (LAN), mientras que los investigadores pueden realizar llamadas bajo demanda para solicitar datos o acciones de forma remota. Como tal, la arquitectura del software Autoculture tiene control desde la nube de AWS para diseñar, iniciar, pausar, editar y detener experimentos según demanda (Fig. 3).

Integración de IoT Cloud: una interfaz gráfica de usuario alojada en Internet transmite mensajes a la plataforma Autoculture a través de MQTT para iniciar, monitorear y finalizar experimentos.

El módulo informático Raspberry Pi se utilizó para ejecutar experimentos localmente y aceptar comandos transmitidos a través de MQTT. La interfaz del programa de aplicación (API) utilizada para enviar comandos en serie a la bomba y las válvulas Tecan se adaptó de un paquete Python de código abierto29. Los protocolos para llevar a cabo experimentos se desarrollaron mediante secuencias cronometradas de acciones unitarias en la bomba y las válvulas. Como usuario, los parámetros y rangos disponibles para construir experimentos automatizados se enumeran en la Tabla 1. En esta arquitectura, la conexión IoT brinda accesibilidad para operar experimentos de forma remota, mientras que los horarios operados localmente en el dispositivo brindan seguridad de operación en el caso de Internet inestable. conexión.

La Figura 4 describe el proceso de fabricación y montaje del chip de microfluidos PDMS. El chip de microfluidos PDMS de vidrio ópticamente transparente tiene el tamaño de una placa de 24 pocillos (85,5 mm × 127,6 mm) para integrarse con herramientas de laboratorio como microscopios, lectores de placas y dispensadores robóticos. Los 24 pocillos aislados se pueden acceder a través de canales cuadrados de 2 mm en la interfaz vidrio-PDMS. Para un acceso conveniente, todas las entradas están ubicadas en una fila en el borde de la cara del chip y todas las salidas están ubicadas en una fila en el borde opuesto. El diseño de microfluidos de circuito abierto aquí contiene pozos que están abiertos al aire. De esta manera, se agotan las burbujas acumuladas en el sistema, se produce un libre intercambio de gases con el entorno de la incubadora y se puede acceder fácilmente a los organoides durante la carga del chip y la conclusión del experimento. Cada pocillo atrapa 120 \(\upmu \hbox {L}\) que pueden usarse como un microambiente, incluido el uso de andamios extracelulares. La entrada y salida de los canales fluídicos están a 5 mm por encima del fondo del pozo, lo que ayuda a mitigar el riesgo de perder una muestra no adherente en el canal de salida.

Fabricación del chip de microfluidos PDMS. (A) Representación gráfica del patrón de molde entrelazado para el sustrato PDMS en el conjunto de chip de microfluidos. (B) Los soportes entrelazados (azul, rojo y verde) se fijan al molde base (púrpura) y definen geometrías de microfluidos sobre el PDMS vertido que se retienen a medida que cura el sustrato. (C) El sustrato PDMS se retira del molde y se une al vidrio. (D) Una representación de la sección transversal del chip. El líquido ingresa desde las entradas de microfluidos en la superficie y sigue canales sellados con vidrio en la parte inferior hasta los pocillos con acceso abierto desde la parte superior. (E) Una placa de interfaz fluídica impresa en 3D (amarilla) conecta 24 líneas de microtubos fluídicos con las entradas/salidas del chip de microfluidos. (F) Chip de microfluidos (centro) con un ejemplo de la placa de interfaz fluídica (izquierda) y la placa de interfaz fluídica completamente instalada (derecha).

Cada placa de interfaz fluídica impresa en 3D conecta simultáneamente 24 líneas (Fig. 4F). Esta es una simplificación en comparación con la inserción de cada línea individualmente, lo cual es común en los microfluidos basados ​​en PDMS. Dentro de los insertos de tubo de la placa de interfaz fluídica, tres púas circulares sellan el tubo Tygon a proyecciones rígidas. Las proyecciones rígidas que contienen el tubo se alinean con los orificios de acceso al canal del chip de microfluidos. Cuando el conjunto de 24 líneas coincide con los orificios moldeados en el PDMS, se forman sellos de orificio con todas las proyecciones de la placa y las líneas de los tubos de la plataforma se alinean con los canales del chip de microfluidos.

El día 12 de desarrollo, los cultivos de organoides cerebrales se transfirieron desde agitadores orbitales (Fig. 5A) a pocillos de microfluidos automatizados (Fig. 5B). El agitador orbital mantiene un régimen de velocidad casi estable de aproximadamente 0,12 m/s30,31,32. Realizamos una simulación de dinámica de fluidos computacional (CFD) utilizando Comsol Multiphysics33 (Fig. 5C) que representa los primeros 2,2 s de medios que se inyectan en el pozo. El fluido entra por la entrada, 5 mm por encima del suelo de vidrio, y entra al pozo a través de una pared inclinada. La simulación comienza con un dominio líquido del medio lleno hasta el nivel de los puertos de entrada/salida con un dominio de aire existente arriba. En la alimentación, el medio ingresa a la cavidad y genera una onda que progresa desde la entrada hasta la salida. El organoide, modelado como una esfera, fijado a 5 mm por debajo de la interfaz aire-medio, no observa la mayor parte de las turbulencias generadas. El sustrato inferior (vidrio) experimenta \(<5\%\) de la velocidad máxima durante la alimentación. Las velocidades en este régimen son instantáneas (a diferencia del estado casi estacionario) y dos órdenes de magnitud menores que las de los agitadores orbitales, lo que induce velocidades más bajas y menos esfuerzo cortante sobre el cultivo. Una de las ventajas de este sistema es que los investigadores pueden adaptar el caudal del medio y el programa de entrega para lograr una difusión óptima de los nutrientes con una mínima alteración del organoide.

La dinámica de fluidos computacional simuló el flujo en los pocillos de cultivo de tejidos individuales utilizando el sistema automatizado. (A) Los cultivos organoides se expanden en placas de pocillos que se giran en un agitador orbital. (B) Después de 12 días, los organoides se trasplantan al pozo de microfluidos automatizado. (C) Un pozo del sistema automatizado propuesto con inyección de fluido constante durante 2 s con líneas de velocidad.

El crecimiento de los organoides cerebrales en Autocultivo se comparó con el de las condiciones del agitador orbital en un experimento de 18 días. Se agregaron células madre pluripotentes humanas para formar organoides y se mantuvieron en condiciones estándar durante los primeros 12 días durante la inducción neural (ver "Métodos"). El lote se dividió y se cargaron 12 organoides en un chip de microfluidos de Autoculture mientras que el resto se mantuvo en una placa de 6 pocillos en un agitador orbital como controles. Cada pocillo se cargó previamente con 50 \(\upmu \hbox {l}\) Matrigel inmediatamente antes de cargar los organoides para adherir cada organoide al centro del pocillo (ver "Métodos"). Los organoides automatizados fueron alimentados con 70 \(\upmu \hbox {L}\) cada hora durante seis días, mientras que los controles fueron alimentados con 2 ml en días alternos. En la automatización, no es necesario retirar periódicamente la placa de pocillos de la incubadora para alimentarla; por lo tanto, este sistema es muy adecuado para el seguimiento longitudinal del desarrollo de organoides. En este estudio, los organoides en la placa de pocillos de Autocultivo se monitorearon una vez por hora utilizando una plataforma de incubación de imágenes de campo brillante34,35.

La Figura 6A muestra la placa de cultivo de microfluidos automatizada dentro de una incubadora colocada en un sistema de imágenes automatizado de múltiples pocillos, habilitado para IoT y controlado remotamente. El sistema de imágenes fue diseñado para monitorear experimentos biológicos en un formato de placa de 24 pocillos, utilizando una cámara dedicada para cada pocillo. Para tener en cuenta el desarrollo tridimensional de los organoides durante todo el experimento, capturamos ráfagas de imágenes, recorriendo el rango de distancias focales que cubren todo el tejido tridimensional. Se utilizó un algoritmo de visión por computadora para detectar las características enfocadas en cada plano focal, generar una imagen compuesta que maximice las características enfocadas en todo el organoide y calcular el área proyectada. Este proceso se describe en trabajos anteriores35. La Figura 6B muestra 12 cultivos de organoides de corteza cerebral (día 12), cargados en pocillos individuales del chip de microfluidos y alimentados en paralelo en la plataforma de Autocultivo para el experimento. La Figura 6C,D muestra el crecimiento de la "Cultura 4" durante seis días sucesivos. Se observó un robusto crecimiento de organoides en los pocillos de Autocultivo y fue consistente con el aumento de tamaño observado en los organoides cultivados en condiciones de control. En comparación con los controles, los organoides automatizados desarrollaron un perímetro menos denso, lo que sugiere que la reducción de las velocidades y las fuerzas de corte puede acomodar el crecimiento y la migración que de otro modo se escindirían.

El día 18, los cultivos se recolectaron y analizaron mediante secuenciación masiva de ARN (RNA-seq) e inmunohistoquímica para evaluar los tipos de células generadas en cada condición y la salud general de los cultivos celulares. Se compararon los transcriptomas de 7 organoides "automatizados" y 4 "suspensivos". La expresión genética de marcadores de tipo celular para neuralepitelia (SOX2), células madre neurales de la glía radial (SOX2, HES5, PAX6, HOPX), progenitores intermedios (EOMES) y neuronas inmaduras (NeuroD1, RELN) no mostró diferencias consistentes entre los autocultivos. y muestras de control que sugieren que la fidelidad de la diferenciación general no se vio afectada por el uso del sistema de Autocultivo (Fig. 7A). De acuerdo con esto, vimos una expresión sólida de los marcadores de proteínas progenitoras neurales, SOX2 y Nestin, mediante inmunohistoquímica en secciones de organoides cultivados en condiciones estándar o de autocultivo (Fig. 7B).

Seguimiento longitudinal del desarrollo de organoides. (A) El chip de microfluidos Autoculture se encuentra en un sistema de imágenes automatizado de 24 pocillos, controlado remotamente y habilitado para IoT. (B) Imágenes de campo brillante de doce cultivos individuales de corteza cerebral de 12 días de antigüedad en el día 1 de alimentación automatizada. (C) Imágenes longitudinales de la "Cultura 4" durante el experimento. (D) Expansión del área proyectada de la "Cultura 4" durante el experimento. Esto se obtuvo utilizando un algoritmo de visión por computadora34.

Al comparar los organoides automatizados y de control, observamos una diferencia significativa en la expresión de genes asociados con el estrés del cultivo celular. Los estudios han demostrado que las vías de glucólisis y estrés del retículo endoplásmico (estrés ER) están reguladas positivamente en los organoides en relación con las muestras de tejido in vivo, y esto se correlaciona con una especificación y maduración del subtipo celular deterioradas17,19. En este estudio, la glucólisis canónica fue la vía deferente principal con la gran mayoría de los genes importantes regulados negativamente de manera constante (consulte las Tablas complementarias 2 y 3). Los genes que están notablemente regulados positivamente en los organoides cerebrales mostraron niveles reducidos en la condición de automatización: ALDOA, ENO1, HK1 y PGK1 tuvieron cambios de -6.9, -10.4, -2.8 y -9.3, respectivamente (Fig. 7A). Además, los marcadores de estrés del RE: ARCN1, GORASP2 y YIPF1 se redujeron mediante cambios de -2,8, -2,2 y -3,0, respectivamente. Consulte la Tabla complementaria 4 para conocer genes de estrés de ER expresados ​​con mayor deferencia.

Resultados de transcripción e imágenes inmunofluorescentes. (A) Comparaciones por pares de expresión de genes seleccionados asociados con la diferenciación neuronal, la glucólisis y el estrés del RE. Los resultados fueron estadísticamente significativos con un valor de p ajustado ≤ 0,05, excepto para HOPX y NES de diferenciación neuronal. Los datos "Automatizados" representan 7 réplicas biológicas y los datos de "Suspensión" representan 4 réplicas biológicas con 6 réplicas técnicas (B). Las tinciones inmunofluorescentes para SOX2, Nestin y DAPI de suspensión y las secciones de organoides automatizadas muestran marcadores progenitores congruentes.

Las crecientes demandas de experimentos a largo plazo, reproducibilidad, paralelización y análisis longitudinal impulsan el cultivo celular hacia la automatización. Este estudio muestra una solución automatizada de microfluidos para el crecimiento y mantenimiento de organoides capaces de existir junto con otros dispositivos de control y detección a través de Internet de las cosas, magnificando la capacidad de capitalizar la robótica de precisión para la experimentación automatizada. La combinación de esta plataforma con la plataforma de imágenes que se muestra aquí (Fig. 6) proporciona un entorno estacionario que permite de manera única el estudio en vivo de organoides individuales a lo largo del tiempo. Esta plataforma podría usarse fácilmente para mantener otros modelos organoides y tejidos ex vivo. El chip de microfluidos de 24 plex descrito aquí también podría adaptarse para apoyar el crecimiento de cultivos adherentes (2D) al incluir un paso de protocolo adicional para tratar el chip de microfluidos con un recubrimiento de superficie de adherencia celular antes de cargar las células.

El uso de agitadores orbitales para el cultivo de organoides a largo plazo se ha adoptado ampliamente en el campo y genera beneficios para la difusión de nutrientes y la homogeneidad del gas disuelto. Sin embargo, las velocidades de los fluidos y las fuerzas de corte presentes no se parecen al entorno embrionario. Los microfluidos, como los del sistema que se muestra aquí, podrían usarse para ajustar las velocidades de los fluidos, las fuerzas de corte y los gradientes de presión, al mismo tiempo que brindan los mismos beneficios a la concentración de nutrientes y gases disueltos a través de regímenes de alimentación rápidos. Nuestro sistema permite un entorno de bajas velocidades. La simulación CFD que se muestra aquí (Fig. 5) representa las condiciones presentes en el experimento de validación que seleccionó preferentemente velocidades bajas; sin embargo, mayores tasas de profusión producirían gradientes de velocidad más altos que podrían usarse para estudiar los efectos sobre la morfología y diferenciación de los organoides.

Reducir los niveles de estrés en modelos de organoides cerebrales es crucial para lograr relevancia fisiológica. Según lo medido por la expresión reducida de la enzima glicolítica, el entorno de la plataforma Autoculture da como resultado organoides con estrés reducido en comparación con las condiciones tradicionales de cultivo en suspensión. Las vías que responden a las condiciones ambientales, como el metabolismo del azúcar, el control de la hipoxia y la producción de proteínas, están interconectadas a través de la vía integrada de respuesta al estrés. Al reducir las fluctuaciones de concentración en los medios de cultivo celular mediante alimentación automatizada, los cultivos pueden experimentar una mayor homeostasis. Se necesita más investigación para comprender los posibles efectos a largo plazo de la reducción de la expresión genética de la glucólisis y los genes de estrés del RE y las condiciones ambientales críticas que subyacen a la firma de expresión genética asociada con el menor estrés celular que observamos. Por ejemplo, no está claro si el agotamiento de nutrientes esenciales, como la glucosa, o la acumulación de metabolitos celulares, como la lactosa, es el factor crítico que conduce a la inducción de genes en la vía de la glucólisis observada en condiciones estándar de cultivo de organoides. Sin embargo, el sistema de Autocultivo que desarrollamos aquí proporciona una plataforma en la que podemos explorar sistemáticamente esta cuestión.

Los medios de cultivo celular se almacenaron en depósitos de botellas de vidrio (Corning) con una tapa de suministro de solvente de múltiples puertos (Spex VapLock) y se almacenaron en \(4^{\circ }\hbox {C}\) durante la duración del experimento. Cada tapa de entrega del depósito contenía un único tubo de microperforación Tygon de 0,030" de diámetro interior x 0,090" de diámetro exterior (Masterflex), sellado por una tuerca de PTFE de dos piezas y un adaptador roscado de casquillo (Spex VapLock), que se extendía desde el fondo del depósito hasta un puerto de entrada en el cabezal de válvula de cerámica de 6 puertos de la bomba de jeringa (Tecan Cavro Centris, vial de vidrio de 1,0 ml). Se permite que aire estéril rellene el depósito a través de un filtro de 0,22-\(\upmu \hbox {m}\) (Millipore) fijado a la tapa para compensar las extracciones de reactivo de la bomba de jeringa. Se utilizaron los mismos tubos de microdiámetro Tygon y adaptadores roscados de tuerca y casquillo de PTFE para conectar la bomba de jeringa a dos válvulas de distribución paralelas de 12 puertos (Tecan SmartValve). Cada tubo de microdiámetro Tygon (Masterflex) de 0,020 ″ de diámetro interior × 0,060 ″ de diámetro exterior que emana de la válvula de distribución se conecta a un único pocillo del chip de microfluidos. El aislamiento fluídico entre los pozos se conserva desde esta unión en adelante. Cada válvula de distribución de 12 puertos da servicio a seis pozos en el chip de microfluidos. Se construyeron sistemas con dos y cuatro válvulas de distribución. La colección de tubos de microdiámetro de 2 m de largo se ató en una trenza para un manejo conveniente y se guió a través del puerto de entrada posterior de una incubadora de cultivo celular estándar (Panasonic) (Fig. 2(4)). En condiciones de incubadora (\(37^{\circ }\hbox {C}\), 5 % de CO2, 95 % de humedad rel.), una única placa de interfaz fluídica impresa en 3D personalizada se unió al conjunto de tubos de microdiámetro para la administración de reactivos. a las entradas del chip de microfluidos y una segunda placa de interfaz idéntica unió el conjunto de tubos de microdiámetro para la aspiración de reactivos a las salidas.

Los tubos de microperforación para aspiración se sacaron de la incubadora y se llevaron a un conjunto de tubos cónicos de 15 ml de un solo uso (Falcon) para la recolección de medios condicionados (Fig. 2(3)). Cada depósito de recolección se tapó con un tapón de goma (McMaster) que contenía dos orificios perforados de 0,06”. Para cada tapón, se insertó en un orificio el tubo de microperforación que obtiene el medio acondicionado del chip de microfluidos, y en el otro orificio se insertó un tubo de microperforación seco para rutas de operación neumática de regreso al cabezal de la válvula de distribución de aspiración. La bomba de jeringa se usó para generar presión negativa sobre cada depósito de recolección en serie para extraer medios acondicionados desde el chip de microfluidos al depósito de recolección. La separación entre el tubo neumático y el tubo de medio acondicionado atrapó la entrada de medio en el depósito de recolección. Todos los tubos de microdiámetro se sellaron herméticamente a la válvula de distribución y a la bomba de jeringa con tuercas de PTFE y adaptadores roscados de férula.

La bomba de jeringa y las válvulas de distribución se conectaron utilizando la configuración de cableado eléctrico de bombas múltiples descrita en el manual de Tecan. Un módulo de cómputo (Raspberry Pi 4) transmitió comunicaciones en serie con el protocolo de comunicación OEM de Tecan utilizando una placa de expansión en serie GPIO TX/RX a DB9M RS232 para Raspberry Pi (Ableconn). El módulo informático Raspberry Pi utilizaba una pantalla táctil de 7” para editar e iniciar protocolos. Se utilizó una interfaz de programa de aplicación (API) Python de código abierto para desarrollar el software necesario para llevar a cabo protocolos en automatización29.

Los microfluidos basados ​​en PDMS se construyeron utilizando un molde de plástico impreso en 3D entrelazado (Fig. 4). Estos se imprimieron con una impresora SLA (Formlabs Form 3) con resina Modelo V2. Los moldes impresos se procesaron posteriormente con sonicación en isopropanol (IPA) durante 20 minutos para eliminar el exceso de resina, seguido de secado en N2. Los componentes secos se curaron bajo luz ultravioleta (405 nm) durante 30 minutos a \(60\,^{\circ }\hbox {C}\). Como se ilustra en la Fig. 3, las piezas del molde se ensamblaron y llenaron con PDMS (Sylgard 184, Dow Corning) preparado mezclando prepolímero de PDMS y un agente de curado (10:1 p/p). Después de llenar el molde, el PDMS se desgasificó en una cámara de vacío durante 1 hora. El molde lleno de PDMS se deja curar durante 24 h a \(60\,^{\circ }\hbox {C}\) antes de retirar el PDMS del molde.

Los sustratos de vidrio de borosilicato (\(101,6\hbox {mm} \times 127,0\hbox {mm}\), McMaster-Carr) se limpiaron mediante sonicación en acetona (10 min), luego alcohol isopropílico (10 min) y se secaron con N2. . El sustrato de vidrio y la superficie de PDMS moldeado se activaron con plasma de oxígeno a 50 W durante 45 s. El vidrio y el PDMS (Fig. 4C) se alinearon a mano, se presionaron y se hornearon a \(100\,^{\circ }\hbox {C}\) en una placa caliente durante 30 minutos, formando un sello irreversible.

Se depositó una capa de 10 \(\upmu \hbox {m}\) de parileno-C (Specialty Coating Systems) sobre el chip de microfluidos para evitar la absorción de moléculas pequeñas por PDMS. Se cargaron dos gotas de silano A-174 (Sigma-Aldrich) en la cámara de deposición para promover la adhesión.

La placa de interfaz fluídica (Fig. 4F) se imprimió en 3D para interconectar el tubo de microdiámetro de 2,2 mm de diámetro exterior (Cole-Palmer) con las funciones de entrada y salida de PDMS. Cada geometría de conector constaba de 24 extrusiones cilíndricas con un diámetro exterior de 2,7 mm y un diámetro interior de 2,2 mm. Dentro de cada orificio había tres púas de 0,2 mm de largo para sujetar el tubo de microperforación cuando se insertaba. Este componente se imprimió con una impresora SLA de Formlabs (Forma 2) con resina Surgical Guide con sonicación en isopropanol (IPA) durante 20 minutos para eliminar el exceso de resina, seguido de secado en N2. Luego, los componentes secos se curaron bajo luz ultravioleta (405 nm) durante 30 minutos a \(60\,^{\circ }\hbox {C}\). Para garantizar la biocompatibilidad, la pieza se recubrió con 5 \(\upmu \hbox {m}\) de parileno-C (Specialty Coating Systems). También se cargaron dos gotas de silano A-174 (Sigma-Aldrich) en la cámara de deposición con el dispositivo para promover la adhesión.

La esterilización de la bomba de jeringa, los cabezales de las válvulas, los tubos, las placas de interfaz fluídica y las tapas de los tubos de recolección se llevó a cabo según la recomendación del proveedor (Tecan). Se empujó un lavado de 10 minutos con etanol al 70% procedente de un depósito de vidrio tratado en autoclave a través de la plataforma hasta los depósitos de recogida mediante la bomba de jeringa. Después de etanol al 70 %, se aplicó un ciclo de secado con aire estéril procedente de un filtro de 0,22 \(\upmu \hbox {m}\) (Millipore) durante 10 minutos. Se realizaron diez ciclos posteriores de agua desionizada, libre de núcleos y secado bajo los mismos parámetros. El chip de microfluidos y los depósitos de medios se esterilizaron en autoclave a \(121^{\circ }\hbox {C}\) durante 45 minutos y se secaron durante 15 minutos inmediatamente antes de su uso. Todos los componentes se transfirieron a través de bolsas selladas esterilizables en autoclave a una cabina de bioseguridad en cultivo de tejidos para la carga de organoides y medios. Los medios suplementados previamente preparados se transfirieron a cada depósito de medios y se taparon (VapLock) y luego se almacenaron en refrigeración durante la duración del experimento.

La línea de células madre embrionarias humanas H9 (WiCell, autenticada en la fuente) se cultivó en placas de cultivo celular recombinantes recubiertas con vitronectina humana (Thermo) en medio StemFlex (Gibco). El subcultivo se realizó incubando placas con EDTA 0,5 mM durante 5 minutos y luego se resuspendieron en medio de cultivo para transferirlas a nuevas placas recubiertas.

Para generar organoides cerebrales, los cultivos adherentes se disociaron en células individuales utilizando el reactivo de disociación celular Accutase (Gibco) y luego se agregaron en placas de 24 pocillos AggreWell 800 (STEMCELL Technologies) a una densidad de 3.000.000 de células por pocillo con 2 ml de medio AggreWell (STEMCELL Technologies). ) complementado con inhibidor de Rho quinasa (Y-27632, 10 \(\upmu \hbox {M}\), Tocris, 1254) (día 0). Al día siguiente (día 1), se reemplazó manualmente 1 ml del medio AggreWell con medio suplementado que contenía inhibidor de WNT (IWR1-\(\varepsilon\), 3 \(\upmu \hbox {M}\), Cayman Chemical, 13659, días 1-10) e inhibidor de Nodal/Activina (SB431542, Tocris, 1614, 5 \(\upmu \hbox {M}\), días 1-10). El día 2, los agregados se transfirieron a un filtro de 37 \(\upmu \hbox {m}\) (STEMCELL Technologies) aspirando cuidadosamente con una pipeta p1000 de diámetro ancho fuera de la placa AggreWell. Los organoides se transfirieron a placas de 6 pocillos de adhesión ultrabaja (Corning) mediante inversión y enjuague de los filtros con medio AggreWell nuevo. Los medios se cambiaron los días 3, 4, 5, 6, 8 y 10 reemplazando manualmente 2 ml de medio acondicionado con medio nuevo. A partir del día 11, el medio se cambió a medio de diferenciación neuronal que contenía medio Eagle: mezcla de nutrientes F-12 con suplemento GlutaMAX (DMEM/F12, Thermo Fisher Scientific, 10565018), suplemento 1X N-2 (Thermo Fisher Scientific, 17502048) , concentrado de lípidos químicamente definido 1X (Thermo Fisher Scientific, 11905031) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina suplementados con un 0,1 % de factor de crecimiento de fibroblastos humano recombinante b (Alamone F-170) y un 0,1 % de factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (R&D Systems 236) -P.EJ).

Los organoides en "suspensión" del grupo de control permanecieron suspendidos en placas de 6 pocillos y se mantuvieron con cambios de medio de 2 ml cada dos días durante el resto del cultivo. Se cargaron organoides "automatizados" del grupo experimental en el chip de microfluidos y experimentaron cambios de medio de 70 \(\upmu \hbox {L}\) una vez cada hora durante el resto del cultivo.

El día 12 de diferenciación de organoides cerebrales, el chip de microfluidos se preparó pipeteando 50 \(\upmu \hbox {L}\) de Matrigel enfriado (aproximadamente \(0\,^{\circ }\hbox {C}\)) hESC Qualif Matrix (BD 354277) en cada pocillo. Inmediatamente después de Matrigel, se transfirieron organoides cerebrales individuales mediante una pipeta p1000 de calibre ancho con 70 \(\upmu \hbox {L}\) de medio condicionado nativo a cada pocillo y se colocaron en el pocillo central para obtener imágenes. El chip se cubrió con una tapa de placa de 24 pocillos y se incubó a \(37^{\circ }\hbox {C}\) durante 15 minutos para fijar el Matrigel. Cada pocillo se llenó con 70 \(\upmu \hbox {L}\) adicionales de medio fresco y se conectó a placas de interfaz fluídica (Fig. 4F) enrutadas a la incubadora a través de un puerto de acceso posterior. Las placas de interfaz fluídica se colocaron a presión en el chip de microfluidos a mano y el chip se colocó en la plataforma de imágenes (si corresponde).

Se utilizó el protocolo Smart-seq236 para generar bibliotecas de secuenciación de ADNc de longitud completa a partir de ARNm organoide completo. Brevemente, se lisaron organoides completos usando tampón de lisis para producir lisado celular que contenía ARNm poliadenilados que se transcribieron de manera inversa con Superscript III (ThermoFisher Scientific) usando un cebador oligoDT (/5Me-isodC/AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN) y el cambio de plantilla se realizó con un oligo de cambio de plantilla. (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrGrG). Las secuencias de cebador oligoDT y oligo de cambio de plantilla sirvieron como sitios de cebador para la amplificación de ADNc aguas abajo (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT). El ADNc se cuantificó utilizando un ensayo fluorométrico de alta sensibilidad de ADN Qubit 3.0 y la calidad se evaluó utilizando un kit de bioanalizador de ADN de alta sensibilidad (Agilent). Se utilizó la transposasa Nextera HT (Illumina) para convertir 1 ng de ADNc en bibliotecas de secuenciación con códigos de barras.

Las lecturas de extremos emparejados se secuenciaron a 75 × 75 pb en un Illumina NextSeq 550, y se secuenciaron con mayor profundidad a 50 x 50 pb en un Illumina NovaSeq 6000 hasta una profundidad de lectura promedio de 65 millones de lecturas emparejadas por muestra. Las muestras se demultiplexaron utilizando códigos de barras Illumina i5 e i7, y las muestras de mayor profundidad se submuestrearon a 100 M utilizando SAMtools37. Las lecturas recortadas se combinaron y alinearon con el genoma humano (ensamblaje hg38 UCSC) con alineación STAR38 (Gencode v37) utilizando el proceso toil-rnaseq39. Los parámetros STAR provienen del proceso DCC de ENCODE40. La expresión genética diferencial se realizó utilizando el paquete DESeq241 en RStudio. El análisis de enriquecimiento del conjunto de genes se realizó utilizando g:Profiler42.

Se recogieron organoides cerebrales, se fijaron en paraformaldehído al 4% (ThermoFisher Scientific #28908), se lavaron con PBS 1X y se sumergieron en sacarosa al 30% (Millipore Sigma #S8501) en una solución de PBS hasta que se saturaron. Las muestras se incluyeron en criomoldes (Sakura - Tissue-Tek Cryomold) que contenían medio de congelación de tejidos (Datos generales, TFM-C), se congelaron y almacenaron a − \(80\,^{\circ }\hbox {C}\). Los organoides se seccionaron con un criostato (Leica Biosystems #CM3050) a 18 \(\upmu \hbox {M}\) en portaobjetos de vidrio. Las secciones de organoides se lavaron tres veces durante 10 minutos en PBS 1X antes de una incubación de dos horas en BSA al 10% en solución bloqueadora de PBS (ThermoFisher Scientific #BP1605-100). Luego, las secciones se incubaron en anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo durante la noche a \(4^{\circ }\hbox {C}\). Al día siguiente, las secciones se lavaron tres veces con PBS 1X durante 30 min. Luego se incubaron en una solución de anticuerpos secundarios diluidos en una solución de bloqueo a temperatura ambiente durante 2 h. Las secciones se lavaron tres veces más en PBS 1X durante 30 minutos.

Los anticuerpos primarios utilizados fueron: conejo anti SOX2 (ab97959, dilución 1:250), pollo anti Nestin (ab134017, dilución 1:250) y DAPI (Sigma D9542-10 mg). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron: cabra anti-conejo Alexa Fluor 594 (ab150080, dilución 1:250) y cabra anti-pollo Alexa Fluor 488 (ab150169, dilución 1:250). Las imágenes se realizaron utilizando el microscopio Zeiss Axioimager Z2 Widefield en el Instituto de Biología de Células Madre de UC Santa Cruz (RRID:SCR_021135) y el software Zen Pro. Las imágenes fueron procesadas usando ImageJ.

La dinámica de fluidos del llenado y drenaje de los pozos se predijo utilizando un software comercial de dinámica de fluidos computacional COMSOL®Multiphysics 5.5 (Estocolmo, Suecia). La Figura 5B muestra los primeros 2 s del ciclo de llenado (\(70\, {\upmu }\hbox {L}\) del medio entregado con una velocidad promedio de \(9.85 \times 10^4\,\hbox {m /s}\)). El pozo tiene \(5\,\hbox {mm}\) de profundidad y un diámetro de \(5.6\,\hbox {mm}\). En esta simulación, las propiedades del medio fueron \(997\,\hbox {kg/m}^3\) densidad y \(6.92 \times 10^3\,\hbox {kg/ms}\) viscosidad. La simulación predice el límite de fase (entre líquido y aire) como una superficie libre43. El dominio de la solución consta de una pared rígida (el pozo) con condiciones límite "antideslizantes" y la superficie superior (la interfaz aire-medio) abierta a la incubadora con condiciones límite "deslizantes". El organoide se simuló como una geometría de esfera fantasma con un diámetro de \(1,8\,\hbox {mm}\). Las condiciones atmosféricas se establecieron a una presión de \(1\,\hbox {atm}\), una temperatura de \(37\,^{\circ }\hbox {C}\) y una composición de gas de \(5 \%\) dióxido de carbono, \(17\%\) oxígeno y \(78\%\) nitrógeno. Visualizamos el campo de velocidad en la sección transversal vertical central del pozo usando líneas de flecha de corriente. La simulación utilizó un total de 519.830 elementos tetraédricos.

Los datos de secuenciación de ARN poliadenilado se han depositado en GSE207894. Los datos de expresión diferencial adicionales que originaron la Fig. 7A están disponibles en las Tablas complementarias 1 a 4.

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Este trabajo fue apoyado por Schmidt Futures SF 857 y el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano con el número de premio 1RM1HG011543 (DH, SRS y MT), el Instituto Nacional de Salud Mental de los Institutos Nacionales de Salud con el número de premio R01MH120295 (SRS) Defense Advanced Agencia de Proyectos de Investigación (DARPA), Oficina de Investigación del Ejército, según el Acuerdo Cooperativo No. W911NF-18-2-0104, y el Departamento del Interior, Premio No. D20AC00003. (MR y MT), la National Science Foundation con el número de premio NSF 2034037 (REG, SRS y MT) y NSF 2134955 (MT, SRS y DH). DH es investigador del Instituto Médico Howard Hughes. Los autores quieren agradecer especialmente a Pattawong Pansodtee, David Parks, Matt Elliott por las discusiones y al IBSC Cell Culture Facility (RRID:SCR 021353) y al UCSC Life Sciences Microscopy Center (RRID:SCR 021135) por sus valiosos recursos y asistencia. .

UC Santa Cruz Genomics Institute, University of California Santa Cruz, Santa Cruz, CA, 95064, USA

Spencer T. Seiler, Gary L. Mantalas, Sebastian Torres-Montoya, Peter V. Baudin, Victoria T. Ly, Liam Tran, Ryan N. Hoffman, Marco Rolandi, Richard E. Green, David Haussler, Sophie R. Salama y Mircea Theodorescu

Departamento de Ingeniería Biomolecular, Universidad de California Santa Cruz, Santa Cruz, CA, 95064, EE. UU.

Spencer T. Seiler, Liam Tran, Richard E. Green y David Haussler

Departamento de Biología Molecular, Celular y del Desarrollo, Universidad de California Santa Cruz, Santa Cruz, CA, 95064, EE. UU.

Gary L. Blankets, Ryan N. Hoffman y Sophie R. Salama

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John Selberg, Sergio Lamb, Sebastian Torres-Montoya, Peter V. Baudin, Victoria T. Ly, Finn Amend, Marco Rolandi y Mircea Theodorescu

Instituto Médico Howard Hughes, Universidad de California, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, 95064, EE. UU.

David Haussler

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STS, JS, SC y FA desarrollaron la plataforma automatizada de cultivo celular de microfluidos. GLM y RNH proporcionaron cultivos celulares. STS y GLM realizaron los experimentos y el análisis del transcriptoma. STM desarrolló la simulación computacional de dinámica de fluidos, PVB y VTL realizó la adquisición y el análisis de imágenes. LT y RNH realizaron tinción inmunohistoquímica. STS generó las fotografías y dibujos de las figuras. MR, DH, SRS, REG y MT supervisaron al equipo y aseguraron la financiación. Todos los autores contribuyeron a escribir el manuscrito.

Correspondencia a Sofie R. Salama o Mircea Teodorescu.

STS y GLM son fundadores de OrganOmics, una empresa que puede verse afectada por la investigación que se informa en el documento adjunto. Todos los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

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Seiler, ST, Mantalas, GL, Selberg, J. et al. La plataforma modular automatizada de cultivo de células de microfluidos reduce el estrés glucolítico en los organoides de la corteza cerebral. Informe científico 12, 20173 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20096-9

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Recibido: 12 de julio de 2022

Aceptado: 08 de septiembre de 2022

Publicado: 23 de noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20096-9

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