Análisis estructural y funcional del sistema linfático del tritón.

Jan 30, 2024

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 6902 (2023) Citar este artículo

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Los vertebrados con capacidad de regeneración, como los tritones y las salamandras, poseen un sistema inmunológico adaptativo debilitado caracterizado por múltiples conexiones entre el sistema linfático y el sistema vascular sanguíneo llamados corazones linfáticos. Se desconoce el papel de la vasculatura linfática y estas conexiones linfáticovenosas en la regeneración. Utilizamos linfangiografía de infrarrojo cercano in vivo, ultrasonografía de frecuencia ultra alta, linfangiografía micro-CT y reconstrucción computarizada tridimensional de secciones histológicas en serie para evaluar los territorios linfáticos de Cynops pyrrhogaster. Utilizamos nuestro modelo y supermicrocirugía para demostrar que los corazones linfáticos no son esenciales para la circulación linfática y la regeneración de las extremidades. En cambio, los tritones poseen una nueva red intraósea de vasos linfáticos dentro del hueso que expresa VEGFR-3, LYVE-1 y CD-31. Sin embargo, no pudimos mostrar la expresión de Prox-1 en estos vasos. Demostramos que la médula ósea del tritón adulto funciona como órgano de drenaje linfático y como depósito de grasa. Este estudio revela las diferencias anatómicas fundamentales entre el sistema inmunológico de los urodelos y los mamíferos y proporciona un modelo para investigar los linfáticos y la regeneración.

El sistema linfático está formado por una red de vasos linfáticos, tejido linfoide y órganos linfoides que forman una parte importante del sistema inmunológico de los vertebrados. Los linfáticos comienzan como vasos con extremos ciegos en el tejido y forman una red extensa en todo el cuerpo, pero aún no se han identificado en la epidermis, el cartílago ni en el hueso sano. En última instancia, todos los vasos linfáticos drenan a la circulación sanguínea a través de conexiones directas entre linfático y vena (linfáticovenosas).

El sistema linfático funciona regulando el entorno circundante de las células dentro de los tejidos controlando la disponibilidad de líquido, macromoléculas y glóbulos blancos, formando un puente importante entre las células, la matriz extracelular y el sistema vascular sanguíneo. Además de su papel tradicionalmente reconocido en el transporte de líquido extracelular, estudios recientes han demostrado que los linfáticos también desempeñan un papel esencial en la cicatrización de heridas, la inmunidad, el metabolismo de las grasas, la metástasis del cáncer y las enfermedades cardiovasculares y metabólicas1,2,3,4,5,6. La falta de regeneración de la vasculatura linfática después de una lesión produce linfedema, una enfermedad desfigurante caracterizada por hinchazón progresiva de las extremidades, deposición de grasa e infecciones repetidas de celulitis que afecta a más de 200 millones de personas en todo el mundo y no tiene cura conocida7.

A pesar de la creciente literatura sobre la importancia de los vasos linfáticos en la cicatrización de heridas y enfermedades, el papel del sistema linfático en la regeneración sigue estando poco estudiado. Una de las principales razones de esto es la falta de conocimiento del sistema linfático en los anfibios urodelos (tritones y salamandras), considerados ampliamente como los mejores modelos para la regeneración de vertebrados debido a su incomparable capacidad regenerativa8. Gran parte del conocimiento actual sobre los linfáticos de los urodelos se basa en estudios realizados hace más de un siglo y en suposiciones a partir de investigaciones sobre anuros (ranas y sapos)9,10,11.

El sistema linfático del urodelo se caracteriza por la presencia de 8 a 23 pares de corazones linfáticos (LH) ubicados en las conexiones linfáticovenosas a lo largo del cuerpo que funcionan para bombear linfa a las venas y prevenir el reflujo de sangre hacia los linfáticos8,10,12. Los LH no son exclusivos de los tritones. Los anuros tienen de 2 a 5 pares, mientras que los reptiles y las aves poseen un par que desaparece en la mayoría de las aves en el período post embrionario temprano10. Los mamíferos, por otro lado, no poseen LH; en cambio, el plexo venolinfático inicial que se forma durante el desarrollo del saco linfático yugular se ha descrito como el homólogo vestigial de la LH13,14. Por lo tanto, los mamíferos post embrionarios tienen sólo 1 par de conexiones linfaticovenosas comunes a todos los tetrápodos ubicadas alrededor de la unión de los conductos torácicos y las venas subclavias. Estas importantes diferencias anatómicas en la circulación linfática de los vertebrados tienen correspondientemente implicaciones significativas en la función del sistema linfático.

La disminución de las conexiones linfáticovenosas se correlaciona notablemente con una disminución de la capacidad de regeneración en los vertebrados (Figura complementaria i). La evidencia de esta relación es vívidamente evidente en el ciclo de vida de los anuros. Como larvas renacuajos, comparten una estructura linfática idéntica a la de los urodelos con 8 o más pares de LH que dan un total de al menos 18 conexiones linfáticovenosas (incluidas las conexiones del conducto torácico a la vena subclavia). Durante esta fase de la vida, los renacuajos, al igual que los urodelos, poseen la capacidad de regenerar la cola, las extremidades y el cristalino del ojo15,16,17. Luego sufren un declive ontogénico, pasando a un estado de regeneración incompetente en la edad adulta con una disminución correspondiente en el número de LH de 2 a 5 pares15,16,17. Los estudios en la rana con garras sudafricana Xenopus laevis han demostrado que los renacuajos hasta las etapas 51 a 52 son capaces de regenerar una extremidad trasera completa con los 5 dedos después de una amputación17,18. Esto disminuye progresivamente a 3,7 dígitos en promedio en la etapa 53 y 2,5 en la etapa 55, acompañado de una pérdida progresiva de la expresión de Sonic hedgehog en el tejido en regeneración17,18,19. Después de la metamorfosis, la regeneración de las extremidades posteriores se limita a la formación de una punta cartilaginosa que carece de dedos o músculos18,20. La etiología de esta disminución progresiva de la capacidad regenerativa en los anuros y en los vertebrados superiores, como los mamíferos, sigue siendo desconocida, y la hipótesis principal atribuye esta disminución a las diferencias en la respuesta del sistema inmunológico a las lesiones20,21,22,23,24. Además, aún se desconoce si la presencia de estas múltiples conexiones linfáticovenosas facilita la regeneración.

En este estudio definimos la anatomía linfática funcional del tritón panza de fuego japonés Cynops pyrrhogaster. Utilizamos nuestro modelo para mostrar que, a diferencia de los anuros, las conexiones linfáticovenosas de LH no son esenciales para la circulación linfática y no son esenciales para la regeneración. En cambio, los tritones poseen una nueva red intraósea de linfáticos que expresan el receptor 3 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR-3), el receptor 1 de hialuronano endotelial de los vasos linfáticos (LYVE-1) y CD-31 que conecta las redes linfáticas superficiales y profundas y mantiene la circulación linfática. incluso después de la escisión de todos los LH. Este es el primer informe sobre linfáticos en huesos sanos y proporciona información sobre las diferencias anatómicas fundamentales en el sistema inmunológico de los urodelos y los mamíferos altamente regenerativos. Este estudio también proporciona un modelo para investigar el papel de la vasculatura linfática en la regeneración y la regeneración de los linfáticos en los urodelos.

En particular, existe una variación considerable en la nomenclatura anatómica utilizada en los urodelos. Esto se debe en gran medida a la escasez de literatura sobre la anatomía vascular de los urodelos y a los hallazgos históricamente contradictorios de los primeros investigadores que han persistido. La histórica monografía de Francis publicada en 1934, La anatomía de la salamandra, incluye la descripción anatómica más detallada de la vasculatura de las salamandras adultas hasta la fecha9. Por tanto, la nomenclatura utilizada en este estudio está acorde con esta monografía9.

Primero evaluamos los territorios de drenaje linfático in vivo utilizando linfangiografía de fluoroscopia de infrarrojo cercano (NIRF) con verde de indocianina (ICG) complementada con ultrasonografía de frecuencia ultra alta (UHFUS) y linfangiografía de contraste por tomografía por microcomputadora (micro-CT). NIRF tiene alta resolución pero poca profundidad de penetración en el tejido, mientras que UHFUS (40–70 MHz) es útil para medir el tamaño y las tasas de pulsación, pero tiene una resolución relativamente pobre y una profundidad de penetración baja. Por otro lado, la micro-CT permite la visualización de redes linfáticas profundas para complementar NIRF y UHFUS. Los vasos linfáticos colectores se definieron funcionalmente como los vasos linfáticos más grandes que acumulan flujo distante.

Identificamos 16 pares de LH laterales ubicados en la parte posterior del tritón desde las escápulas hasta la base de la cola y los numeramos de LH1 a LH16 respectivamente. El ICG fluyó rápidamente hacia los LH entre 2 y 5 minutos después de la inyección y alcanzó su punto máximo entre 10 y 15 minutos. Las extremidades y la cola fueron drenadas constantemente mediante vasos linfáticos colectores bien definidos en LH específicas (Fig. 1a). En la extremidad anterior, los linfáticos corren en la cara dorsal de la extremidad posteriormente a una red de axila y luego drenan principalmente a LH2 y LH3, luego a LH1, LH4 y LH5 a través de conexiones del tronco linfático longitudinal lateral (TLyLL). Los colectores linfáticos en la superficie ventral conectaban la red de la axila con los colectores de la cabeza y la extremidad anterior contralateral (Fig. 1b). De manera similar, en la extremidad trasera, 2 linfáticos colectores principales en el dorso corren posteriormente a la pelvis inferior, luego drenan a LH11 y LH12 y luego a LH8, LH9, LH10, ​​LH13, LH14, LH15 y ocasionalmente LH16 a través de conexiones TLyLL (Fig. 1c). . Los vasos colectores también discurren anteriormente, cruzando ventralmente la línea media y conectándose a una red alrededor de la cloaca y a los colectores de la extremidad trasera contralateral. La cola fue drenada por 2 colectores que corrían a lo largo de la cresta lateral en los lados izquierdo y derecho que continuaban anteriormente para formar el TLyLL y drenaban en LH16 y luego en LH15 (Fig. 1d, e).

Territorios linfáticos mapeados mediante linfangiografía fluoroscópica infrarroja cercana con verde de indocianina in vivo. (a) Diagrama que muestra los territorios de flujo linfático de la extremidad anterior del tritón (azul), la extremidad trasera (amarilla) y la cola (verde) mapeados utilizando verde de indocianina (ICG) cerca de fluoroscopia de infrarrojos (NIRF). Los troncos linfáticos longitudinales laterales (TLyLL) (puntas de flecha blancas) recorren el cuerpo interconectando todos los corazones linfáticos (LH) (círculos verdes). (b) Los linfáticos de las extremidades anteriores (puntas de flecha azules) corren en dirección anterior a una densa red de axila y drenan principalmente en LH2 y 3 (círculos verdes), luego en LH1, 3 y 5. Los linfáticos recolectados de la axila cruzaron la línea media en la superficie ventral para unirse los colectores de la región de la cabeza y la extremidad anterior contralateral. Los lugares de inyección del ICG se muestran con puntas de flecha rojas. (c) Los linfáticos de las extremidades posteriores (puntas de flecha amarillas) corren posteriormente y fluyeron principalmente a LH11 y LH12 (círculos verdes) y luego a LH8, 9, 10, 13, 14 y 15. Los linfáticos de las extremidades posteriores se conectaron a una red densa alrededor de la cloaca. Los vasos linfáticos del lado derecho (d) y del lado izquierdo (e) de la cola (puntas de flecha verdes) fueron drenados por respectivos vasos linfáticos ipsilaterales con los colectores principales de la izquierda y la derecha siguiendo un curso ligeramente diferente anteriormente y procedieron a formar el TLyLL en cada lado. El líquido linfático de la cola drenaba hacia LH16 (círculo verde) y luego a LH15 a través del TLyLL. (f) Diagrama que muestra los territorios de flujo linfático de la extremidad anterior de la rana (azul) y la extremidad trasera (magenta) mapeados utilizando ICG NIRF. Los grandes sacos linfáticos subcutáneos (amarillos) que conectan los linfáticos de las extremidades y la LH (círculos verdes). (g) La extremidad trasera de la rana fue drenada principalmente por colectores dorsales (puntas de flecha magenta) hacia los LH posteriores (círculos verdes) y algo de líquido fluyó hacia los grandes sacos linfáticos subcutáneos (contorno amarillo). Los linfáticos de las extremidades anteriores fluyeron rápidamente hacia los sacos linfáticos, oscureciendo la vasculatura linfática más profunda antes de fluir hacia los LH posteriores (puntas de flecha azules). Los lugares de inyección del ICG se muestran con puntas de flecha rojas. No se observaron sacos linfáticos subcutáneos en los tritones.

En Xenopus, el drenaje de las extremidades posteriores se realizó principalmente a través de colectores dorsales hacia los LH y sacos posteriores (Fig. 1f, g). En la extremidad anterior, el ICG se acumuló rápidamente en grandes sacos linfáticos subcutáneos que oscurecen la vasculatura más pequeña. Luego, el líquido de los sacos linfáticos fluyó hacia los LH posteriores. No encontramos tales sacos linfáticos en los tritones. En cambio, el exceso de tinte se acumuló en espacios extravasculares, especialmente alrededor del tejido subcutáneo de la pelvis y la axila y a lo largo de las vainas nerviosas que no estaban revestidas por endotelio, lo que se confirma por la ausencia de marcadores endoteliales VEGFR-3, LYVE-1 y CD-31 (Figuras complementarias ii). y iii). No se observó acumulación de líquido en estos espacios cuando se inyectaron pequeñas cantidades de medio de contraste, lo que sugiere que el flujo linfático en estas vías extravasculares tiene un papel limitado en la circulación fisiológica. No se observaron muertes ni cambios en el movimiento o el comportamiento alimentario después de la administración de ICG en animales seguidos durante hasta 4 años.

La tasa de LH en reposo varió de 60 a 122 latidos por minuto (lpm) intercalados con períodos de asistolia y aumentó a 72-156 latidos por minuto después de la inyección de 50 μl de tinte. Cada LH latía de forma independiente con un ritmo irregular y no había sincronicidad entre las LH ipsilaterales o contralaterales adyacentes. Las tasas de pulsación fueron generalmente similares en todos los LH. La inyección de tinte en una región provocó un aumento simultáneo en la tasa de todas las LH, incluidas aquellas que no comparten el mismo territorio de drenaje sin recolección de tinte (datos no mostrados), lo que sugiere un control centralizado del sistema nervioso autónomo.

Se utilizó un modelo matemático elipsoide (Fig. 2a) para estimar la fracción de eyección (FE) en UHFUS y para calcular el gasto cardíaco de LH (LHO) (Fig. 2b, c). La FE media fue de 60,40 %, EDV de 0,026 mm3, frecuencia de LH de 117,04 lpm, LHO de 1,838 mm3/min por LH y el total combinado para los 16 pares fue de 58,816 mm3/min. Por lo tanto, los tritones son notablemente capaces de bombear un volumen de líquido linfático equivalente a su masa corporal de 5 a 6 g cada 1 a 2 h hacia la circulación venosa periférica a una velocidad de 10 ml.Kg-1.min-1.

Cálculo basado en ultrasonido de frecuencia ultraalta del gasto cardíaco linfático del corazón de tritón. (a) La estructura del corazón linfático (LH) consta de una única cámara muscular que recibe líquido linfático de los colectores linfáticos y bombea este líquido hacia la vena lateral. El LH tiene una válvula de entrada y una válvula de salida que evitan el reflujo de sangre. La reconstrucción del volumen 3D por computadora mostró que la forma del corazón linfático del tritón se ajustaba mejor a una forma similar a un elipsoide con un extremo de salida ligeramente puntiagudo y un extremo de entrada aplanado; por lo tanto, la fracción de eyección (EF) se calculó utilizando un modelo matemático elipsoide basado en 2D ultra alto. medición de frecuencia ultrasónica del volumen diastólico final (EDV) (b) y del volumen sistólico final (c) de LH, y la frecuencia de LH. La FE media fue 60,40% (DE 12,94), EDV 0,026 mm3 (DE 0,008) y la frecuencia cardíaca linfática media fue de 117,04 lpm (DE 23,12), dando un gasto cardíaco (LHO) de LH de 1,838 mm3/min para cada LH y un total combinado de 58,816 mm3/min para los 16 pares.

Para evaluar las redes linfáticas profundas, realizamos una linfangiografía por micro-CT que mostró un flujo de líquido linfático a través de la línea media hacia el lado contralateral del cuerpo a través de las costillas, las vértebras y los linfáticos vertebrales profundos (Fig. 3a). Procedimos a evaluar la microcirculación del tritón para confirmar la ubicación de estas vías linfáticas alternativas mediante seccionamiento en serie con reconstrucción de volumen tridimensional (3D) por computadora respaldada con inmunohistoquímica y microscopía electrónica de transmisión (TEM). Para garantizar la eliminación de los glóbulos rojos, evitar el colapso de la luz de los vasos linfáticos y mejorar la fijación, preparamos el tejido para la reconstrucción del volumen vascular 3D mediante fijación con perfusión a través del sistema linfático. La fijación por perfusión translinfática utilizó la rápida circulación linfática, múltiples conexiones linfáticovenosas anatómicas y la escasez de válvulas venosas que permiten el flujo bidireccional a los lechos capilares para fijar adecuadamente al tritón y prevenir el colapso de los vasos linfáticos. Los urodelos tienen 4 pares de grandes vasos linfáticos colectores que corren longitudinalmente a lo largo del tronco, el TLyLL que corre a lo largo de los LH y los abastece directamente, los troncos linfáticos longitudinales parabdominales (TLyLPab) y los troncos linfáticos longitudinales parepigastrici (TLyLPe) que corren en los lados lateral y ventral. capas subcutáneas de la pared del tronco, respectivamente, y troncos linfáticos longitudinales subvertebrales (TLyLSv), que son los más grandes de los cuatro y se extienden profundamente en el tronco inmediatamente ventral a la columna vertebral9.

Microcirculación del tritón y red linfática de la médula ósea intraósea. (a) La linfangiografía por micro-CT mostró que el movimiento del contraste inyectado en la extremidad trasera izquierda (punta de flecha roja) fluyó a través de los colectores (puntas de flecha amarillas) hasta los corazones linfáticos (LH) (punta de flecha verde) y hacia el hueso vertebral hasta los colectores contralaterales (punta de flecha azul). ), LH contralaterales (puntas de flecha magenta) y los troncos linfáticos longitudinales laterales (TLyLL) (puntas de flecha blancas). (b) La unidad linfática funcional repetida a lo largo del tronco del tritón. La LH ingresa desde la red linfática superficial a través de TLyLL y los linfáticos intraóseos vertebrales transversales (TvIL) que conectan la red linfática profunda con la red linfática superficial y las LH en ambos lados del cuerpo. (c) y (d) Reconstrucción de volumen 3D por computadora en sección serial que muestra los vasos linfáticos (verde) y los vasos sanguíneos (rojo). Se muestra que las TvIL (puntas de flecha amarillas) fluyen desde el hueso hasta las LH. Los LH anteriores del tronco (c) estaban más estrechamente unidos a la costilla adyacente, mientras que en la cola (d) estaban separados de los huesos por el músculo esquelético. (e) y (f) Inmunohistoquímica que muestra vasos linfáticos intraóseos y vasos sanguíneos en la médula ósea de la apófisis transversa de una costilla abdominal (barras de escala = 100 μm) (e) y la vértebra de la cola (barras de escala = 200 μm) (f ). Las células endoteliales linfáticas se identificaron mediante una alta captación de rodamina-dextrano y tinción con VEGFR-3+, LYVE-1+, CD-31+, mientras que las células endoteliales de los vasos sanguíneos fueron CD-31+, LYVE-1 ±, VEGFR-3- y baja rodamina. -captación de dextrano.

La red linfática estaba organizada funcionalmente en una red dérmica superficial y subdérmica, y una red visceral profunda con algunos vasos pequeños que atraviesan la capa muscular principalmente en los tabiques intermusculares que conectan las dos (Figuras complementarias iv y v). La red superficial incluía un fino plexo linfático dérmico estrechamente asociado con el moco y las glándulas venenosas de la piel y un plexo subdérmico que contenía TLyLL, TLyLPab, TLyLPe y los colectores segmentarios del cuerpo. La red linfática profunda incluía el TLyLSv, el plexo vertebral de los linfáticos y los vasos profundos que corren a lo largo de los vasos sanguíneos y nervios principales en los espacios intermusculares para unirse a los linfáticos viscerales intraabdominales e intratorácicos profundos que eventualmente drenan en las venas principales hacia el corazón sanguíneo. No se observaron linfáticos en la epidermis. Tampoco se observaron vasos sanguíneos en la epidermis. En cambio, los vasos sanguíneos formaron un plexo subepidérmico denso extremadamente rico. El músculo también poseía una extensa red de vasos sanguíneos que conectaban los vasos sanguíneos superficiales y profundos. La vena lateral (VL) que recibe la producción de LH discurre en la capa subdérmica junto con la TLyLL.

Descubrimos que la LH tenía 2 entradas principales, el TLyLL que recolectaba los linfáticos superficiales y una nueva red linfática intraósea en el hueso que se conecta a los linfáticos profundos del TLyLSv (Fig. 3b). La red linfática intraósea consistía en un vaso linfático colector principal que denominamos vaso linfático intraóseo vertebral transverso (TvIL) dentro de las apófisis transversas vertebrales y costillas acompañadas por 1 o 2 venas que conectan la salida de VL LH con el plexo venoso subvertebral, que denominamos estas son las venas intraóseas vertebrales transversales (TvIV) (Fig. 3c, d, Vídeos 1 y 2). Tanto el TvIL como el TvIV tenían pequeñas ramas y afluentes que formaban una red dentro de la médula ósea que se conectaba con el periostio y el músculo circundante. Las venas tenían marcadamente más afluentes y se caracterizaban por la presencia de múltiples válvulas que dirigían el flujo de sangre medialmente al plexo venoso subvertebral. Aparte de las 2 válvulas en los extremos de entrada y salida de las LH, no se observaron otras válvulas en la vasculatura linfática, lo que permitió un flujo de líquido bidireccional fácil y una respuesta rápida a los cambios en la circulación linfática.

La presencia de una red linfática intraósea funcional se confirmó mediante la captación de colorante rodamina-dextrano en los vasos VEGFR-3 +, LYVE-1 +, CD-31 + (Fig. 3e, f). El análisis TEM (Fig. 4a-d) también confirmó la ultraestructura de los vasos linfáticos dentro de la médula ósea y los contrastó con los vasos sanguíneos25.

Ultraestructura de los linfáticos y venas intraóseas y del corazón linfático. (a) Sección de escaneo teñida con azul de toluidina incrustada en resina de una costilla abdominal de tritón que muestra los linfáticos intraóseos vertebrales transversales (TvIL) (b) y las venas intraóseas vertebrales transversales (TvIV) (c) dentro de la médula ósea y el corazón linfático adyacente ( LH) (d). La microscopía electrónica de transmisión confirmó que TvIL ((b) barra de escala = 2 μm) y LH ((d) barra de escala = 20 μm) estaban revestidas por células endoteliales linfáticas (LEC) con las características ultraestructurales características del endotelio linfático, incluida la ausencia de pericitos, paredes delgadas y citoplasma LEC altamente atenuado (puntas de flecha verdes (b)), con uniones estrechas escasas, pocas uniones adherentes, espacios ocasionales entre las LEC (puntas de flecha amarillas (b y d')) y uniones de células endoteliales en forma de hojas superpuestas (azul punta de flecha (d')). El músculo LH especializado tenía rasgos característicos tanto del músculo cardíaco como del esquelético (punta de flecha blanca (d')). Por el contrario, los TvIV ((c) Barra de escala = 5 μm) estaban revestidos por células endoteliales sanguíneas (BEC), tenían paredes más gruesas, rodeadas de pericitos (puntas de flecha magenta (c)) con varias uniones estrechas y uniones adherentes (puntas de flecha rojas (c) )) y tenía múltiples vesículas de citoplasma. También se observaron glóbulos rojos en los vasos sanguíneos.

Esta estructura que consta de colectores linfáticos superficiales, que llevan linfa desde los segmentos periféricos del cuerpo a los LH a través de TLyLL, TvIL que transporta linfa entre los linfáticos profundos y LH, y los LH que bombean linfa hacia el VL formaron la unidad linfática funcional básica que era repetido a lo largo de todo el tronco del tritón (Fig. 3b). En los linfáticos anteriores que drenan la extremidad superior, el pecho y el abdomen, el TvIL corre dentro de las costillas y era el vaso de entrada más grande y predominante de la LH, mientras que en la cola predominaban los colectores superficiales que drenan las extremidades posteriores y la cola. Los LH anteriores (Video 1) también estaban más estrechamente unidos a la cara dorsal posterior de la costilla adyacente, mientras que en la región de la cola (Video 2) estaban ubicados un poco más lejos de los huesos separados por algún músculo esquelético. El análisis de secciones en serie de todos los huesos de las extremidades anteriores y posteriores, las costillas y las vértebras del cuello, el tronco y la cola proximal, la cintura escapular y la cintura pélvica mostraron que la médula ósea del tritón era altamente vascularizada, hipocelular y ampliamente llena de tejido adiposo (suplementario). Figuras vi y vii).

Las LH son esenciales para la circulación linfática en los anuros13,26,27. La interrupción experimental de su función mediante anestesia o ablación produce hemoconcentración, edema y muerte inevitable en ranas y sapos en 2 a 4 días13,26,27. Para evaluar la función diferencial de LH en tritones y Xenopus, realizamos escisiones supermicroquirúrgicas incrementales de LH. De acuerdo con informes anteriores13,26,27, la escisión de los 2 pares de LH posteriores en Xenopus resultó en edema, aumento de peso posoperatorio (PO) de 18 a 29 % y muerte dentro de las 12 h en todas las ranas a pesar de la presencia de LH anteriores intactos. (Figura complementaria viii). Curiosamente, ninguno de los tritones desarrolló edema, cambios de comportamiento o murió en el período de observación de 1 mes a 1 año después de la escisión de LH regional o de los 16 pares de LH (Fig. 5a).

Cambios fisiológicos en la circulación linfática después de la escisión del corazón linfático. (a) La escisión de corazones linfáticos (LH) en tritones no causó edema, cambios histológicos ni muerte (barras de escala = 1 mm). No hubo diferencias significativas en los diámetros de las extremidades una semana después de la operación (PO) (t(9) proximal = 0,729, p = 0,485, t(9) media = − 0,504, p = 0,627, t(9) distal = 0,297 , p = 0,773) entre los tritones de escisión de LH y los controles con buena confiabilidad entre evaluadores ICC = 0,893, IC del 95% (0,825, 0,934). (b) La linfangiografía por micro-CT mostró una reducción del contraste linfático en la circulación sanguínea en tritones por escisión de LH a los 90 días PO, con flujo colateral de Trunci Lymphatici longitudinales parabdominales (TLyLPab) (puntas de flecha amarillas). El análisis de la vena cava posterior (VCP) mostró que los tritones con escisión de LH tenían un valor de gris medio significativamente menor (t(34) = − 3,156, p = 0,003) que los controles. (c) El análisis de linfangiografía por fluorescencia con rodamina-dextrano del flujo linfático a venoso (barras de escala = 100 μm) también mostró una disminución significativa en la densidad de los vasos sanguíneos que reciben líquido linfático (t(188) = 13,057, p <0,001) a los 28 días después de la escisión de todas las LH, pero esto volvió a la normalidad a los 120 días PO (t (161) = − 0,854, p = 0,394). (d) La ecografía de frecuencia ultraalta mostró un aumento significativo (t(12) = − 2,707, p = 0,019) en la tasa de LH en tritones a los que se les realizó una escisión bilateral de LH posterior. (e) El flujo colateral mantuvo la circulación linfática después de la escisión de LH. Se muestra la garantía de TlyLPab (puntas de flecha amarillas) con conexiones a TvIL (punta de flecha magenta). Estos resultados confirmaron que la escisión de LH terminó con éxito el flujo linfático a vena periférico durante 90 días, después de lo cual se restableció el flujo linfático a vena normal a los 120 días PO. Los datos representan la media ± desviación estándar (barras de error).

La evaluación cuantitativa del flujo linfático a venoso se realizó mediante micro-CT cuantitativa de la vena cava posterior (VCP) (Fig. 5b) y midiendo la densidad de los vasos sanguíneos intramusculares que habían recibido tinte de rodamina-dextrano de los linfáticos (Fig. 5c). El VCP es una veta importante con un curso constante en los tritones. A diferencia de otras venas principales, encontramos que el VCP, al igual que los vasos sanguíneos intramusculares, no estaba acompañado por múltiples vasos linfáticos grandes, lo que los hacía ideales para estudiar el flujo linfático periférico a las venas. Los tritones sometidos a escisión de LH tuvieron un flujo linfático-venoso significativamente menor a los 28 días PO (p < 0,001) y a los 90 días (p = 0,003) que aumentó a valores normales después de 120 días (p = 0,394), lo que confirma que la eliminación de LH terminó efectivamente con el flujo linfático-venoso. conexiones y reducción del flujo linfático a venoso.

Para determinar por qué los tritones no desarrollaron ningún síntoma de disfunción linfática después de la escisión de LH, realizamos una evaluación circulatoria fisiológica después de la escisión de algunas o todas las LH. UHFUS mostró que la tasa de bombeo de los LH anteriores restantes en los tritones a los que se les extirpó los LH posteriores fue significativamente mayor que la de los controles (Fig. 5d). Este aumento compensatorio de la actividad de LH aumentó correspondientemente la producción de cada LH en un 20%, pero la producción combinada general de los 9 pares restantes (41,454 mm3/min) fue aún menor que la producción combinada de los tritones normales. La linfangiografía por micro-CT de tritones por escisión de LH mostró el agrandamiento de los vasos linfáticos colaterales en el plano subdérmico que corren longitudinalmente y transportan líquido linfático a los TvIL (Fig. 5b, e).

Para confirmar si las LH se regeneran, realizamos disección microquirúrgica in vivo en serie, UHFUS y linfangiografía micro-CT después de la escisión completa de LH únicas y múltiples. La regeneración siguió consistentemente 5 etapas morfológicas (Fig. 6a-e). Después de la resolución del coágulo, se observó por primera vez una angiogénesis robusta y una restauración de la estructura de los vasos sanguíneos principales en los primeros 28 a 60 días PO (Fig. 6a-e). Esto fue seguido por linfangiogénesis 50 a 80 días PO (Fig. 6e, f) y regeneración completa de los LH 100 a 130 días PO (Fig. 6g), y los LH de cola más caudal tardaron un poco más en regenerarse completamente y reanudar el bombeo que los LH. más LH del tronco craneal. Las LH regeneradas tenían tamaño, forma, estructura, ubicación y función idénticas a las de la LH original, incluidas válvulas y flujo completamente funcionales, como lo demuestra la absorción de colorante rodamina-dextrano (Figs. 6g y 7). Las células endoteliales linfáticas (LEC) recién regeneradas tenían una fuerte expresión de VEGFR-3, LYVE-1 y CD-31 (Fig. 7).

Etapas morfológicas de la regeneración linfática del corazón tras la escisión completa. (a) Corazón linfático normal (LH) (puntas de flecha magenta) con su nervio irrigador (puntas de flecha azules), los troncos linfáticos longitudinales laterales (TLyLL) (puntas de flecha negras) y la vena lateral (VL) (puntas de flecha rojas). La función de LH se confirmó mediante la recolección de rodamina-dextrano (barras de escala = 100 μm). (b) El defecto del tejido inmediatamente después de la escisión de LH. También se resecó un segmento de TLyLL, VL y el nervio irrigador, todos los cuales están íntimamente asociados con la LH. (c) Etapa 1 posoperatoria (PO), días 5 a 10: a la formación del coágulo le siguió la acumulación de una masa de tejido blando y frágil debajo de la epidermis de la herida. (d) Etapa 2 PO Día 28-40: angiogénesis de varios vasos sanguíneos pequeños que interconectan los extremos cortados de la VL y los otros vasos sanguíneos principales. No se observa linfangiogénesis en el sitio de la lesión. La histología mostró músculo y fibroblastos en regeneración, pero no linfáticos funcionales sin colección de rodamina-dextrano. (e) Etapa 3 PO Día 50–60: Maduración de los vasos sanguíneos que restauran su tamaño y estructura originales y restauración de la continuidad de la VL. Se observaron pequeños vasos linfáticos brotando desde los bordes de la herida hacia la zona de la lesión. (f) Etapa 4 PO Día 80-100: Maduración de los vasos linfáticos con flujo activo y acumulación de tinte observado como una masa quística en la región de la LH original, pero sin pulsaciones. (g) Etapa 5 PO Día 100-130: regeneración completa de LH con pulsación. Los LH regenerados tenían válvulas de entrada y salida completamente funcionales y absorción de rodamina-dextrano, lo que confirma que eran completamente funcionales.

Expresión de marcadores de células endoteliales linfáticas en linfáticos recién regenerados. Secciones histológicas que muestran el corazón linfático (LH) regenerado (punta de flecha amarilla) y la costilla adyacente (punta de flecha azul) en la región abdominal 120 días después de la escisión microquirúrgica completa. Los LH recién regenerados tenían forma, tamaño, estructura, posición y función idénticas a los del LH ​​original. Además, la LH recién regenerada demostró una fuerte expresión de los marcadores de células endoteliales linfáticas VEGFR-3 y LYVE-1 y del marcador panendotelial CD-31. La absorción de colorante rodamina-dextrano confirmó que los vasos linfáticos eran completamente funcionales (barras de escala = 200 μm).

Se realizó un ensayo controlado aleatorio para evaluar la función de las conexiones linfáticovenosas de la LH en la regeneración de las extremidades utilizando el modelo linfático de las extremidades posteriores. Se realizó una escisión supermicroquirúrgica incremental de LH9 a LH15 en los tritones del estudio y una operación simulada en los controles seguida de la amputación de la extremidad trasera izquierda (Fig. 8a). Los dos grupos tenían una longitud media similar desde el hocico hasta la cola, grupo de estudio (101,55 mm, DE 4,57) y controles (101,97 mm, DE 4,82) t(60) = − 0,352, p = 0,726, y peso corporal medio similar, estudio grupo (5,37 g, DE 1,22) y los controles (5,45 g, DE 1,17) t(60) = − 0,245, p = 0,808. Todos los tritones recibieron el tratamiento experimental asignado. El seguimiento se completó en 52 tritones, 10 tritones, 4 de estudio y 6 controles, no pudieron recuperarse completamente de la anestesia y murieron después de la cirugía, pero esta diferencia no fue significativa p = 0,732. No hubo diferencias significativas en el tiempo necesario para alcanzar cada una de las etapas de regeneración entre los tritones del estudio y los controles. El número medio de días para alcanzar el criterio de valoración de la etapa de crecimiento digital fue de 47,81 días (DE 8,56) en el grupo de estudio y 47,52 días (DE 10,137) en los controles, p = 0,773 (Fig. 8b). Un análisis de subgrupos adicional no mostró diferencias estadísticamente significativas entre la escisión de LH unilateral y bilateral, y entre la amputación el mismo día de la escisión de LH y la amputación retrasada de 1 semana (Fig. 8c-i).

Ensayo de control aleatorio que evalúa el resultado de la escisión del corazón linfático sobre la tasa y morfología de la regeneración de las extremidades. (a) Diseño del ensayo de control aleatorio: se inscribieron n = 62 tritones y se separaron en 4 bloques, cada bloque fue asignado al azar a un grupo de estudio y control por un asistente independiente ciego. El seguimiento se completó en 52 tritones, 10 tritones murieron inmediatamente después de la operación. (b) No hubo diferencias estadísticamente significativas en la tasa general de regeneración entre los grupos de estudio y control (Kolmogorov-Smirnov Z = 0,662, p = 0,773). (c-h) El análisis de subgrupos tampoco mostró diferencias estadísticamente significativas en las tasas de regeneración entre los tritones de estudio y de control después de la escisión unilateral de LH (Kolmogorov-Smirnov Z = 0,730, p = 0,660), independientemente del momento de la amputación amputación inmediata después de LH escisión (Kolmogorov-Smirnov Z = 0,617, p = 0,841) y amputación retrasada 1 semana después de la escisión de LH (Kolmogorov-Smirnov Z = 0,661, p = 0,774). De manera similar, no se encontraron diferencias significativas entre los tritones del estudio y los de control después de la escisión incremental de LH bilateral (Kolmogorov-Smirnov Z = 0,778, p = 0,579) independientemente del momento de la amputación, amputación inmediata (Kolmogorov-Smirnov Z = 1,284, p = 0,074) y la amputación se retrasó 1 semana PO (Kolmogorov-Smirnov Z = 1,193, p = 0,116). (i) La comparación de los tritones del estudio de escisión de LH de los diferentes lotes experimentales (excluidos los controles) tampoco mostró diferencias significativas en el tiempo necesario para completar la regeneración (Kruskal-Wallis H(3) = 0,1.229, p = 0,746). (j) La comparación de las anomalías morfológicas en las extremidades regeneradas no mostró diferencias estadísticamente significativas (p = 0,150) entre los tritones del estudio y los de control. Los datos representan la media ± desviación estándar (barras de error).

Menos tritones en el grupo de estudio desarrollaron anomalías en las extremidades regeneradas en comparación con los controles; sin embargo, esta diferencia no fue estadísticamente significativa (Fig. 8j). Las anomalías más comunes de las extremidades observadas fueron duplicaciones de dígitos (n = 6 tritones) y dígitos faltantes (n = 4 tritones).

La microcirugía reconstructiva linfática del linfedema ha establecido que, al igual que los angiosomas de los vasos sanguíneos, la vasculatura linfática, a pesar de sus extensas interconexiones, también está organizada en unidades funcionales con colectores linfáticos específicos que drenan preferentemente un bloque tridimensional específico de territorio tisular, también conocido como linfosoma28,29,30. Definir estos territorios es fundamental para comprender la anatomía funcional, el desarrollo embriológico, el tratamiento microquirúrgico y el modelado experimental del sistema linfático. En este estudio, evaluamos la anatomía linfática funcional del tritón y revelamos una nueva red linfática dentro de la médula ósea que conecta las redes linfáticas superficiales y profundas. Utilizamos nuestro modelo y supermicrocirugía de precisión para demostrar que las múltiples conexiones linfáticovenosas de LH, que son una característica distintiva importante de los sistemas linfático e inmunológico de los tritones y otros vertebrados altamente regenerativos (Figura complementaria i), no son esenciales para la regeneración. Además, demostramos que los tritones son capaces de regenerar LH completamente funcional después de una escisión completa en un proceso paso a paso característico. Por lo tanto, los tritones proporcionan un modelo útil para investigar tanto el papel de la vasculatura linfática en la regeneración como la regeneración de los linfáticos. Sin embargo, las notables diferencias anatómicas entre urodelos, anuros y mamíferos encontradas en este estudio deben tenerse en cuenta a la hora de traducir los resultados.

Históricamente, la investigación linfática ha ido a la zaga de la de los vasos sanguíneos porque los linfáticos son generalmente más pequeños, difíciles de visualizar sin el uso de tintes de contraste y comparten muchos marcadores moleculares con los vasos sanguíneos, lo que hacía difícil discriminarlos antes de la llegada de los marcadores LEC Prox-1. VEGFR-3, LYVE-1 y podoplanina. Panizza fue el primero en estudiar los linfáticos de las salamandras en 1883 utilizando mercurio como agente de contraste, pero fue muy criticado por causar deformación de espacios linfáticos más grandes debido a su peso y fue reemplazado por colorantes líquidos y semigelatinosos9,10. Estos métodos no eran adecuados para su uso in vivo y revelaban poco sobre la anatomía linfática funcional. Utilizamos ICG NIRF como nuestra modalidad principal complementada con UHFUS y linfangiografía micro-CT para definir los territorios linfáticos de las extremidades anteriores, posteriores y la cola del tritón in vivo y validamos nuestro modelo al mostrar una disminución del flujo linfático a las venas después de la escisión de LH. Estas regiones fueron seleccionadas para crear modelos linfáticos porque son las más utilizadas en la investigación de regeneración. Una limitación importante de NIRF que observamos tanto en tritones como en ranas es que los pigmentos oscuros de su piel absorben la luz infrarroja cercana. Por lo tanto, tuvimos que utilizar animales albinos transgénicos, lo que posteriormente limitó el tamaño de nuestras muestras.

Nuestros hallazgos mostraron que el sistema linfático de los urodelos es considerablemente diferente al de los anuros. Aunque el 60,40 % de FE que encontramos en las LH de los tritones fue comparable al 20 al 80 % reportado en los anuros, las tasas de LH y la FE de los tritones no mostraron una amplia variación con el estado de alerta del animal26,31. La producción combinada total resultante de 10 ml.Kg-1 min-1 de los 16 pares de LH en tritones también fue el doble de los 0,9-5 ml.Kg-1 min-1 estimados que fluyen a través de todos los LH de los anuros26. Paradójicamente, a diferencia de los anuros, ni la anestesia general completa ni la escisión completa de algunas o todas las LH en los tritones provocaron disfunción linfática o muerte, sino que se movilizó rápidamente el flujo colateral y se restableció la circulación. Este reclutamiento de colaterales tras la interrupción de algunos colectores linfáticos importantes es compartido por la mayoría de los demás vertebrados, excepto los anuros. En este sentido, el sistema linfático de los urodelos comparte anatómicamente más similitudes con otras clases de vertebrados que el de los anuros adultos. Además, demostramos que los tritones no poseen los grandes sacos linfáticos subcutáneos característicos de los anuros adultos10,32. El resultado de la biología única de los anuros significa que su flujo linfático depende en gran medida del movimiento muscular y la ventilación pulmonar para el flujo de linfa periférica hacia los sacos linfáticos y son igualmente dependientes de sus LH para el drenaje de la linfa a la circulación sanguínea. Por lo tanto, el sistema linfático de los anuros representa una adaptación de distracción altamente especializada para satisfacer las necesidades únicas de la arquitectura corporal de los anuros en lugar del modelo anfibio exclusivo de progresión evolutiva.

Sorprendentemente, identificamos una nueva red intraósea de linfáticos en la médula ósea de tritones normales que conecta la red linfática superficial, el plexo vertebral profundo más grande y los LH. El paso preferencial de estos vasos a través de la cavidad ósea proporciona protección mecánica contra el colapso de la luz del vaso. Esta extensa red mantuvo la circulación linfática incluso después de la eliminación de todas las LH, previniendo la disfunción linfática en los tritones. En particular, no pudimos utilizar la expresión de Prox-1 para la identificación de LEC a pesar de múltiples intentos en diferentes condiciones experimentales. Por lo tanto, adoptamos un enfoque multimodal que combina la reconstrucción 3D por computadora de secciones seriadas con linfangiografía Micro-CT respaldada por análisis de expresión de células endoteliales VEGRF-3 y LYVE-1, estudios de inyección de colorante TRITC-dextrano y análisis TEM para demostrar de manera integral la presencia de un vaso linfático. red en los huesos vertebrales y las costillas (Figs. 3 y 4). Sin embargo, aún se requiere la tinción con Prox-1 para demostrar definitivamente la identidad linfática de los vasos VEGFR-3+ y LYVE-1+ en las vértebras, las costillas y los huesos largos (Figura complementaria v).

A pesar de ser un órgano linfoide primario clave del sistema linfático en muchos vertebrados, la vasculatura linfática en el hueso sólo se ha identificado en estados patológicos que incluyen tumores óseos vasculares y tumores óseos malignos primarios y secundarios extensos33,34,35. La aversión ósea de los mamíferos a los linfáticos se destaca de manera más dramática en la enfermedad de Gorham-Stout, un trastorno poco comprendido que se caracteriza por la aparición de vasos linfáticos en el hueso que conducen a una resorción ósea altamente destructiva y progresiva que provoca la desaparición total del hueso afectado36. Nuestros resultados muestran que a pesar de la presencia de vasos linfáticos, el hueso del tritón adulto no es un órgano linfoide primario ni secundario37,38, sino que funciona como un importante órgano de drenaje linfático y un depósito de grasa en los tritones. Especulamos que los linfáticos también pueden funcionar en el metabolismo y la movilización de este depósito de grasa de la médula ósea.

A diferencia del sistema inmunológico innato, el papel del sistema inmunológico adaptativo en la regeneración del tritón no se conoce bien. Los análisis de scRNA-seq en ajolote han identificado consistentemente marcadores de células T y B tac e igll5 en etapas críticas de la regeneración de las extremidades39,40,41. Sin embargo, nuestro resultado que no muestra cambios significativos en la regeneración después de la escisión de los componentes principales de la vasculatura del sistema linfático del tritón, en consonancia con informes anteriores sobre la escisión del órgano linfoide secundario más grande, el bazo, sugiere fuertemente que la respuesta inmune adaptativa no puede ser esencial para la regeneración. pero, en cambio, puede tener una función reguladora42.

El linfedema es el resultado directo de una función deteriorada de la vasculatura linfática. Los mecanismos precisos detrás del fracaso de la regeneración linfática después de una lesión por cirugía y quimiorradiación siguen siendo desconocidos43. La cicatrización y la fibrosis mediadas por TGF-β1, así como la esclerosis y la pérdida de la actividad de bombeo de los vasos linfáticos colectores, se reconocen como pasos precipitantes en la fisiopatología del linfedema43,44. Aparte de la LH, los vasos linfáticos de los anfibios carecen tanto de las paredes musculares pulsantes como de las válvulas que se observan en los linfáticos colectores de los mamíferos45. Este atributo hace que los LH sean ideales para modelar los aspectos estructurales y funcionales de los linfáticos colectores humanos. En particular, a diferencia del músculo liso que se encuentra en los mamíferos recolectores, la musculatura LH del tritón comparte las características del músculo esquelético y cardíaco13,46. Demostramos que los tritones son capaces de regenerar LH después de una escisión completa. La alta expresión de VEGFR-3 en las LEC recién regeneradas sugiere que, al igual que los mamíferos, la regeneración linfática en los tritones también puede depender de la vía VEGF-C/VEGFR-347. Especulamos que el daño de la inervación puede ser la razón por la cual los LH más caudales retrasaron la reanudación de la actividad de bombeo. Los estudios en ranas demostraron que el bombeo de LH tarda entre 20 y 30 días en recuperarse después de la denervación46. La regeneración observada de la vasculatura sanguínea que precede a los linfáticos recuerda al desarrollo embriológico de Prox-1 que expresa linfáticos que brotan de los vasos sanguíneos48,49. Los estudios futuros deberían centrarse en la fuente de las LEC en las LH en regeneración, la expresión espaciotemporal diferencial de Prox-1, LYVE-1, VEGFR-3, SOX18 y otros factores asociados con la linfangiogénesis, así como los factores que influyen en la recuperación completa. de la actividad de bombeo.

Clínicamente, la creación microquirúrgica de anastomosis linfáticovenosa (LVA), ya sea sola o como LVA eferente en transferencias de ganglios linfáticos vascularizados, se considera ahora ampliamente el principal tratamiento quirúrgico del linfedema y los trastornos del flujo linfático50,51,52,53. Estos funcionan de manera muy similar a las conexiones linfáticovenosas naturales de LH de los tritones. Por lo tanto, centramos nuestro estudio en estas conexiones porque presentan una oportunidad fácilmente disponible para la traducción quirúrgica de posibles beneficios terapéuticos en pacientes más allá de la circulación de líquidos. La falta de asociación de las conexiones linfáticovenosas con la regeneración encontrada en este estudio ofrece información preliminar sobre la biología del tejido en curación después de una LVA. Sin embargo, la estrecha asociación de las conexiones linfáticovenosas de la LH del tritón con los linfáticos óseos intraóseos, que están naturalmente ausentes en los humanos, presenta un recordatorio importante de las diferencias en la fisiología linfática entre los tritones y los humanos. Abordar las funciones inmunológicas y metabólicas de esta red linfática intraósea puede proporcionar información sobre la ausencia evolutiva de linfáticos en el hueso humano, su papel en las enfermedades, la inmunidad, el metabolismo de las grasas y posiblemente en la regeneración.

Los tritones japoneses adultos albinos transgénicos y de tipo salvaje Cynops pyrrhogaster, de 90 a 120 mm de longitud desde el hocico hasta la cola, se obtuvieron de la Facultad de Ciencias de la Vida y el Medio Ambiente de la Universidad de Tsukuba54. Las ranas con garras sudafricanas Xenopus Laevis, de tipo salvaje y albinas, se obtuvieron en una tienda de mascotas local. Los tritones de tipo salvaje y todas las ranas se alojaron en el Departamento de Cirugía Plástica de la Universidad de Mie, mientras que los tritones albinos se alojaron en la Facultad de Ciencias de la Vida y el Medio Ambiente de la Universidad de Tsukuba. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones aprobadas por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Mie y el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Aprobación de la Universidad de Tsukuba (Código de registro 170110). Todos los métodos se realizaron e informaron de conformidad con las directrices ARRIVE 2.055.

Los animales recibieron anestesia con una solución de FA100 al 0,1 % (4-alil-2-metoxifenol; DS Pharma Animal Health, Osaka, Japón) en agua a temperatura ambiente durante 1 a 2 h antes de los procedimientos experimentales56.

La linfangiografía ICG NIRF se realizó en tritones albinos transgénicos54 (n = 9 tritones) y ranas albinas (n = 3 ranas). Se utilizó una inyección subcutánea con una aguja 34G de 10 a 20 µL de una solución 1:1000 de Diagnogreen 25 mg/ml (Daiichi Sankyo, Tokio, Japón) diluida con agua estéril para inyección para evaluar el flujo linfático en condiciones fisiológicas normales y se utilizaron 50 µL. Se utiliza para evaluar el drenaje excesivo de líquido tisular. Las inyecciones de las superficies dorsal y ventral de la mano (extremidad anterior) y el pie (extremidad posterior), y los lados izquierdo y derecho de los 10 a 15 mm distales de la cola se evaluaron por separado. El flujo linfático se visualizó y registró utilizando una cámara PDE Neo NIRF (Hamamatsu Photonics, ciudad de Hamamatsu, Japón) con gran aumento mantenida a 15-25 cm de distancia de los animales.

La inmunohistoquímica se realizó como lo describieron previamente Casco-Robles et al.57. Brevemente, las muestras se lavaron en PBS, TritonX-100 al 0,2% en PBS y nuevamente en PBS durante 15 minutos cada una, se incubaron en una solución de bloqueo (suero de cabra normal al 2% (S-1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.)/0,2 % TritonX-100 en PBS) durante 2 h, se lavó como antes y luego se incubó en anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo. Para la tinción con VEGFR-3 se utilizó tTBS en lugar de PBS. Los estudios de tintes de fluorescencia se realizaron utilizando tetrametilrodamina-dextrano de 2.000.000 MW (Invitrogen D-7139) reconstituido en agua estéril para inyección inyectada por vía subcutánea de 20 a 50 μl y muestras de tejido recolectadas 10 a 15 minutos después. Los vasos linfáticos se identificaron y diferenciaron de los vasos sanguíneos comparando la captación diferencial de rodamina-dextrano y la tinción diferencial de VEGFR-3, LYVE-1 y CD-31. Las LEC se identificaron como VEGFR-3+, LYVE-1+, CD-31+ y las BEC se identificaron como CD-31+, LYVE-1±, VEGFR-3-. Se intentó una identificación adicional de los vasos linfáticos mediante tinción con anticuerpos Prox-1 disponibles comercialmente en tritones adultos maduros en diferentes condiciones experimentales, sin embargo, esto no tuvo éxito (datos no mostrados). Las imágenes histológicas se capturaron utilizando un microscopio Keyence BZ-X710 y una Olympus AX80 junto con una cámara digital de microscopio Olympus DP74. El procesamiento de imágenes se realizó utilizando la Imagen J58,59.

Se adquirieron los siguientes anticuerpos, Anti-LYVE-1 Novus (NB600-1008), Anti-CD-31 Bioss (BS-0195R), Anti-LYVE-1 Abcam (Ab14917). El anticuerpo anti-VEGFR-3 fue creado a medida por Eurofins Japan basándose en el ortólogo de nucleótidos de tritón. En los datos complementarios se proporcionan más detalles sobre los anticuerpos utilizados.

Después de la anestesia, se inyectaron por vía subcutánea 50 μl de tinte ICG en las extremidades o la cola de los tritones y las ranas. Se realizó una incisión cutánea longitudinal en la espalda inmediatamente inferior a la cresta de la línea lateral que recubre las LH que se eliminarán utilizando un bisturí quirúrgico n.° 15 y se levantó un colgajo de piel de 2 a 3 mm de ancho en el plano subdérmico utilizando la técnica de disección de supermicrocirugía y OMS. Microscopios quirúrgicos 800 y OMS 610A (Topcon, Tokio, Japón) para preservar las perforantes de los vasos sanguíneos de la piel. Las LH se identificaron visualmente mediante pulsaciones y recolección de tinte ICG. Las LH se extirparon utilizando una técnica de supermicrocirugía e instrumentos de supermicrocirugía de titanio (EMI Factory CO., Ltd. Nagano, Japón) para preservar cuidadosamente el tejido circundante en el grupo de estudio, mientras que en los controles se realizó una cirugía idéntica pero las LH se dejaron intactas. Los colgajos de piel se cerraron mediante suturas interrumpidas de nailon 10/0.

Se inscribieron un total de 62 tritones en el ensayo de control aleatorio y se dividieron en 4 bloques diseñados para evaluar la regeneración después de la escisión incremental de LH y la regeneración después de la aparición de cambios circulatorios a 1 semana PO. Luego, un asistente independiente y ciego (del Departamento de Cirugía de HPB) asignó al azar a los tritones en grupos experimentales aproximadamente iguales utilizando SPSS 26. Se utilizaron pruebas T independientes para comparar la longitud media del hocico a la cola y el peso de los dos grupos. Las 7 LH que drenan la extremidad inferior se identificaron en todos los tritones y se extirparon utilizando una técnica supermicroquirúrgica como se describió anteriormente en el grupo de estudio, mientras que en los controles se realizó una disección idéntica pero las LH se dejaron intactas. Se amputó la extremidad trasera izquierda 2 mm proximal a la articulación de la rodilla utilizando un bisturí quirúrgico número 10 y se recortó el fémur que sobresalía al ras de la herida. Se aplicó una presión suave durante unos minutos para lograr la hemostasia. No fue posible cegar a los investigadores debido a la naturaleza quirúrgica del tratamiento experimental. Sin embargo, para limitar el sesgo, el grupo asignado fue revelado a los microcirujanos sólo después de la exposición de la herida y la microdisección linfática. Los tritones se mantuvieron sin alimentar en recipientes de plástico separados a temperatura ambiente, se observaron diariamente y se registró la etapa morfológica de regeneración60. Nuestro protocolo original planeó la evaluación del tiempo de regeneración de las extremidades por parte de 3 investigadores ciegos. Sin embargo, nos apartamos del protocolo debido a la disponibilidad limitada de personal entre 2020 y 2021 y, en cambio, un único investigador no ciego realizó esta evaluación. La tasa de regeneración se comparó entre los grupos de estudio y control mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov de dos muestras. La prueba de Kruskal-Wallis se utilizó para el análisis de subgrupos de los tritones por escisión de LH del grupo de estudio. Dos investigadores ciegos realizaron la evaluación de la morfología de las extremidades regeneradas. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para comparar las proporciones de extremidades regeneradas morfológicamente anómalas y muertes por PO.

En los tritones (n = 6 tritones del grupo de estudio, n = 5 tritones de control) se midió el diámetro de la extremidad trasera izquierda en 3 puntos; 3 mm proximal a la articulación del tobillo, en la articulación de la rodilla y en el muslo 2 mm proximal a la rodilla 1 semana después de la escisión de la LH por 2 asistentes ciegos e independientes. El coeficiente de correlación intraclase se calculó basándose en un modelo de efectos mixtos bidireccional, de calificación media (k = 2), de acuerdo absoluto. Para las ranas (n = 2 ranas), se secaron con palmaditas con una toalla de papel para eliminar el exceso de agua y se midió el peso corporal total utilizando una microbalanza digital.

La densidad de vasos intramusculares positivos para rodamina-dextrano se evaluó contando el número de vasos en un campo de 20 × en 24 a 36 secciones transversales de parafina diferentes de la base de la cola, el abdomen y el pecho de cada tritón. Se evaluaron n = 3 tritones 28 días después de la escisión de todas las LH, n = 1 tritón evaluado después de 120 días y n = 3 tritones de control 28 días y 120 días después de una operación simulada. Se utilizaron pruebas T independientes para comparar las densidades de vasos entre grupos.

La linfangiografía por micro-CT se realizó con CosmoScan GXII (Rigaku, Tokio, Japón) antes y 10 a 60 minutos después de la inyección subcutánea de 10 a 50 μl de Iohexol (Omnipaque®300, GE Healthcare Pharma, Tokio, Japón) y las imágenes se procesaron con RadiAnt. Software de visualización DICOM. El análisis cuantitativo del VCP se realizó utilizando la imagen J59. El valor gris medio de la sección transversal del VCP se midió en 6 puntos diferentes a lo largo de su recorrido desde la pelvis hasta el hígado en cada tritón y se utilizó una prueba T independiente para comparar el estudio (n = 3 tritones) y el control (n = 3 tritones) grupos.

Se realizó UHFUS en 6 tritones (n = 2 tritones normales, n = 2 tritones con resección de LH, n = 2 tritones con operación de control) utilizando VeVo MD UHF70 (FUJIFILM Visualsonics, FUJIFILM, Tokio, Japón) antes y después de la inyección de 20–50 μL solución salina en las extremidades. Se utilizó un total de n = 8 LH de 2 tritones para calcular LH EF. Se utilizó un total de n = 3 LH de 2 tritones del estudio y n = 11 LH de 1 control y 2 tritones normales para comparar la compensación de la tasa de LH después de la escisión de la LH posterior utilizando una prueba T independiente.

Para la escisión única de LH (n = 5 tritones), se elevó un colgajo de piel de 2 × 4 × 2 mm en la cola proximal y se extirpó una única LH utilizando una técnica supermicroquirúrgica como se describe anteriormente. La regeneración se evaluó abriendo el colgajo de piel a intervalos semanales y luego mensuales durante 150 días. Para la escisión múltiple de LH, se observaron n = 1 tritón después de la escisión de los 16 pares de LH y n = 16 tritones del grupo de estudio del experimento de regeneración de extremidades entre los días 100 y 150 abriendo colgajos de piel a lo largo del área donde se extrajeron las LH y mediante linfangiografía por micro-CT. Se realizaron linfangiografía con tetrametilrodamina-dextrano e IHC en secciones histológicas seriadas a los 28 días (n = 3 tritones) y 120 días (n = 1 tritón).

FixLyP se realizó para limpiar los glóbulos rojos de los vasos sanguíneos y reparar los vasos linfáticos para evitar su colapso en preparación para la reconstrucción volumétrica 3D por computadora de portaobjetos en serie. Se realizó una incisión en la piel abdominal en la línea media, teniendo cuidado de no penetrar el peritoneo. El VCP (diámetro 0,3 a 0,5 mm) se identificó a medida que asciende desde la pelvis hasta el hígado, inmediatamente por debajo del peritoneo, utilizando un microscopio quirúrgico. Se abrió el peritoneo, se aplicaron pinzas microvasculares de pequeño tamaño en sentido proximal y distal y se cortó la vena 5 mm antes de ingresar al hígado. El extremo cefálico de la vena se preparó utilizando una técnica microquirúrgica estándar para diseccionar la adventicia. Luego se insertó una aguja vascular microvascular roma y de punta redonda en el extremo cefálico de la vena y se soltaron las pinzas vasculares. Se inyectó lentamente solución salina de heparina fría a 4 °C en la vena utilizando una jeringa de 1 ml, permitiendo que el extremo caudal de la vena sangrara libremente hasta que el color del hígado se volvió blanquecino y se observó drenaje de solución salina de heparina transparente. A continuación, se inyectó lentamente paraformaldehído frío al 4% (PFA) a 4 °C a 20–50 μl/peso corporal (g)/min en el tejido subcutáneo de las extremidades y la cola hasta que el cuerpo del tritón se volvió rígido. Luego se recogieron muestras y se colocaron inmediatamente en PFA al 4% frío durante 4 h y luego se desmineralizaron con EDTA durante 2 días.

Se tiñeron secciones en serie incluidas en parafina de 5 μm de espesor con HE y se escanearon a 20 × utilizando un escáner de diapositivas digital NanoZoomer S360 (Hamamatsu Photonics K. K, Hamamatsu, JAPÓN). La reconstrucción digital del volumen por computadora en 3D de 900 diapositivas en serie del abdomen y la cola se realizó utilizando el complemento TrakEM2 Image J (FiJi Versión 1.53f51)58,59. En los casos en los que una sección de tejido estaba muy distorsionada o dañada por artefactos de preparación, la imagen se excluía de la pila y se duplicaba la imagen adyacente que mejor se ajustaba para mantener el volumen del tejido. Los vasos linfáticos se rastrearon y marcaron de forma retrógrada, mientras que los vasos sanguíneos se marcaron en forma anterógrada desde los LH (Figura iv complementaria).

Las muestras se prefijaron en glutaraldehído al 2, 5% durante 2 h a 4 ° C, luego se desmineralizaron usando K-CX (Falma, Tokio, Japón), se lavaron 3 veces en PBS durante 10 minutos y se fijaron posteriormente en OsO4 al 1% durante 1 h. El lavado con PBS se repitió dos veces durante 15 minutos y la muestra se deshidrató en concentraciones crecientes de etanol y luego se transfirió a acetona. Las muestras fueron infiltradas y luego embebidas en resina epoxi. Se prepararon secciones de escaneo en serie de 400 μm teñidas con azul de toluidina para microscopía óptica y se cortaron secciones de 80 nm para microscopía electrónica de transmisión y luego se observaron utilizando un microscopio electrónico JEM-1400Flash (JEOL, Tokio, Japón).

Los análisis se realizaron utilizando SPSS 26 (IBM Corp. lanzado en 2019. Armonk, NY) y SPSS 27 (IBM Corp. lanzado en 2020. Armonk, NY). Todas las pruebas estadísticas realizadas fueron de 2 colas, considerándose estadísticamente significativo p < 0,05.

Presentado en la 31.ª Conferencia Científica Anual de Cirugía Plástica de la Universidad de Tokio, enero de 2020, Tokio, Japón.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Células endoteliales de los vasos sanguíneos.

verde indocianina

Linfangiografía por fluoroscopia de infrarrojo cercano

Célula endotelial linfática

corazón linfático

Ultrasonografía de frecuencia ultra alta

Troncos linfáticos longitudinales laterales

Troncos linfáticos longitudinales paraabdominales

Troncos linfáticos longitudinales parepigástricos

Troncos linfáticos subvertebrales longitudinales

Vasos linfáticos intraóseos vertebrales transversales

Venas intraóseas vertebrales transversales

Vena cava posterior

Venosa lateral

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Este trabajo fue financiado por las subvenciones KAKENHI de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (Números de subvenciones: 21K09764 y 18H04061). Nos gustaría agradecer sinceramente a la Sra. Kiku Shinano por el apoyo administrativo general ofrecido y al Dr. Jackson Chipaila, al Prof. Taizo Shiraishi, al Dr. Takahara Iino y a la Sra. Miyuki Namikata por ayudar con los experimentos.

Este trabajo fue financiado por las subvenciones KAKENHI de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (Números de subvención: 21K09764 y 18H04061).

Departamento de Cirugía Plástica y Reconstructiva, Facultad de Medicina, Universidad de Mie, 2-174 Edobashi, Tsu, Prefectura de Mie, 514-8507, Japón

Chihena H. Banda, Makoto Shiraishi, Kohei Mitsui, Yoshimoto Okada, Kanako Danno, Ryohei Ishiura, Kaho Maemura y Mitsunaga Narushima

Facultad de Ciencias de la Vida y el Medio Ambiente, Universidad de Tsukuba, 1-1-1 Tennodai, Tsukuba, Prefectura de Ibaraki, 305-8571, Japón

Chikafumi Chiba

Departamento de Inmunoterapia Personalizada contra el Cáncer, Facultad de Medicina, Universidad de Mie, 2-174 Edobashi, Tsu, Prefectura de Mie, 514-8507, Japón

Akira Mizoguchi

Departamento de Patología y Biología Matricial, Facultad de Medicina, Universidad de Mie, 2-174 Edobashi, Tsu, Prefectura de Mie, 514-8507, Japón

Kyoko Imanaka-Yoshida y Kazuaki Maruyama

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CHB, MS, MN, CC y Ko.M. diseñó el estudio. CHB, MS, MN, YO, KD, RI, Kah.M. y CC realizó la adquisición de datos. CHB, MS, MN, Ka.M y CC participaron en el análisis e interpretación de los datos. CHB redactó el manuscrito y MS, RI, MN, YO, KD, Ko.M., Ka.M., KIY, AM, CC revisaron el manuscrito. Todos los autores enumerados aprobaron la versión final del manuscrito y aceptaron ser personalmente responsables del contenido de este estudio.

Correspondencia a Mitsunaga Narushima.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Banda, CH, Shiraishi, M., Mitsui, K. et al. Análisis estructural y funcional del sistema linfático del tritón. Representante científico 13, 6902 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34169-w

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Recibido: 19 de diciembre de 2022

Aceptado: 25 de abril de 2023

Publicado: 27 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34169-w

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